3.3.11. Тест на образование индола и сероводорода

Многие виды микроорганизмов с выраженной протеолитической активностью обладают способностью расщеплять белок и пептоны до продуктов глубокого распада в виде индола и сероводорода.

Индол образуется при расщеплении сложной гетероциклической кислоты – триптофана. Для выявления индолообразования используют мясо-пептонный бульон (МПБ), содержащий 0,01 % триптофана (см.ниже); или 1%-ю казеиновую воду состава (г/100 мл): казеин 1,0; Na₂HPO₄ – 0,2; NaCl – 0,3; или 2-3%-ную пептонную воду (г/100 мл): пептон -2,5; Na₂HPO₄ – 0,2; NaCl – 0,3. Во всех случаях рН сред 7,2-7.4. среды разливают в пробирки по 8-10 мл и стерилизуют при 1,0 атм.

Приготовление раствора триптофана: навеску триптофана вносят в воду и прибавляют по каплям 5-10 %-ный раствор NaOH до полного его растворения; стерилизуют отдельно при 0,5 атм 15 мин и добавляют к стерильному бульону до концентрации в среде 0,01 %.

Индол можно обнаруживать двумя способами, в которых используется контроль – стерильная среда.

Способ 1. Исследуемой культурой микроорганизмов инокулируют среды. Сразу же после посева в пробирку вносят полоску индикаторной (фильтровальной) бумаги, пропитанной насыщенным раствором щавелевой кислоты так, чтобы индикаторная бумага не касалась питательной среды, для чего верхнюю треть полоски прижимают пробкой к стенке пробирки. Посевы инкубируют 1-2 суток при температуре 37 ⁰С или другой оптимальной в течение 5-7 суток. Образование индола определяют по окрашиванию нижнего конца индикаторной бумаги в бледно-розовый цвет, хорошо заметный в проходящем свете.

Способ 2. Исследуемой культурой микроорганизмов инокулируют питательные среды. Через 5-7 суток культивирования проводят качественную реакцию на присутствие индола с реактивом Эрлиха: пара-диметиламинобензальдегид – 1,0 г; этиловый спирт – 95 мл; HCl концентрированная – 20 мл. Для этого на поверхность среды, не перемешивая, помещают 1-2 мл реактива Эрлиха. Появление красной окраски свидетельствует об образовании индола.

Выявление способности микроорганизмов продуцировать сероводород основано на реакции образования сульфидов металлов. Сероводород является конечным продуктом расщепления серосодержащих аминокислот: цистина, цистиина и метионина. Петлю исследуемой культуры микроорганизмов засевают в пробирку с МПБ, содержащим 0,01 % аминокислоты (добавляют к стерильному бульону в виде раствора в подкисленной дистиллированной воде, который стерилизуют фильтрованием). Сразу же после посева в пробирке прикрепляют полоску бумаги, пропитанную раствором уксуснокислого свинца (см. ниже). Пробку пробирки заворачивают полиэтиленом. Продолжительность культивирования 7-10 суток. Об образовании сероводорода судят по черно-бурому окрашиванию нижней части бумаги, когда бесцветный ацетат свинца превращается в сульфат свинца.

Приготовление бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца: нарезают полоски фильтровальной бумаги размером 0,2-0,45-6 см, погружают их в 5%-ный водный раствор уксуснокислого свинца, высушивают на воздухе и стерилизуют в чашках Петри автоклавированием при 0,5 атм. перед использованием бумага должна быть бесцветной.

Для выявления образования сероводорода можно воспользоваться средой следующего состава (г/л):пептон – 10,0; NaCl – 5,0; цитрат NH₄Fe – 0,30; агар – 15,0; дрожжевой автолизат – 2,0 мл; водопроводная вода, рН 7,0. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм, после чего готовят скошенный агар и делают посевы штрихом. О выделении H₂S судят по почернению среды вследствие образования сульфида железа.

Положительный результат — Proteus vulgaris, Bacteroides ovatus, Bact.macacae; отрицательный — Enterobacter cloacae, Erwinia amalovora, Serratia marcescens.