3.3.1. Тест на наличие каталазы

Посев производят в пробирках на скошенный мясо-пептонный агар или другую среду, не содержащую крови. После инкубации вливают вниз по косяку 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Сразу же и через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков, которое означает положительную реакцию. Параллельно добавляют несколько капель 3%-ной перекиси водорода и к колониям на чашке или к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверхности полужидкой среды. Реакцию можно проводить и на предметном стекле: в этом случае на предметное стекло наносят несколько капель перекиси водорода, петлей снимают колонию и проводят наблюдения. В случае бульонной культуры к 0,5 мл культуры добавляют 0,5 мл 3%-ной перекиси водорода и наблюдают за постоянным образованием пузырьков. Некоторые бактерии, например молочнокислые на средах с низкими концентрациями глюкозы или вообще без глюкозы, образуют внегемовую псевдокаталазу. Образование псевдокаталазы можно предотвратить добавлением к среде глюкозы (1%). При проверке анаэробов на каталазную активность важно перед добавлением перекиси водорода выдержать культуру на воздухе в течение 30 мин. Положительный результат — Staphilococcus epidermidis, Escherichia coli, Mycjbacterium spp.; отрицательный — Streptococcus spp, Clostridium spp., Lactococcus lactis.

3.3.2. Тест на наличие оксидазы

Метод 1 (метод Ковача). На отрезок фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1%-ного водного раствора дигидрохлорида тетра метил-п-фенилендиамина, приготовленного в тот же день. Выросшую культуру снимают с поверхности агаровой среды платиновой петлей (обычные петли из нихромовой проволоки могут давать ложноположительную реакцию) и наносят ее на увлажненную бумагу. Положительная реакция — развитие фиолетовой или пурпурной окраски в течение 10 с. Положительный результат дает Ps. aeruginosa, отрицательный — Е. coli.

Метод 2 (метод Эрлиха). Этот метод менее чувствительный, но более удобный. Несколько капель смеси (1: 1 по объему) 1%-ного раствора α-нафтола, растворенного в 95%-ном этаноле, и свежеприготовленного 1%-ного водного раствора оксалата диметил-и-фенилендиамина наносят на колонии в чашках с arapoм. В другом варианте к жидкой культуре добавляют 0,2 мл α-нафтола и 0,3 мл диметилпарафенилендиамина и энергично перемешивают. Положительная реакция: окрашивание колоний или бульонной культуры в фиолетово-синий цвет в течение 10 — 30 с.

3.3.3. Окислительно-ферментативный (о/f) тест на использование глюкозы (тест Хью — Лейфсона)

Готовят основной раствор исследуемого углевода (обычно глюкозы), стерилизуют его путем фильтрования (или в автоклаве при 0,5 атм) и добавляют с соблюдением правил асептики при 45 — 50⁰ в автоклавированную полужидкую основную среду до конечной концентрации 0,5 — 1%. Чаще всего используют основную среду Хью и Лейфсона (г/л): пептон — 2; NaCl — 5; К₂НРО₄ — 0,3; бромтимоловый синий — 0,03; агар — 3; вода дистиллированная.

Если микроорганизмы не способны расти на этой среде из-за недостатка необходимых питательных веществ, добавляют дрожжевой экстракт (0,1%) или сыворотку крови (2%). Когда кислотообразование маскируется веществами щелочной природы, образующимися из пептона, можно использовать среду следующего состава (г/л): NН₄Н₂РО₄ — 1,0; KC1 — 0,2; MgSO₄ — 0,2; дрожжевой экстракт — 1,0; бромтимоловый синий — 0,03; вода дистиллированная; агар — 2,0; рН среды 7,0. В случае, когда рост тестируемого организма ингибируется бромтимоловым синим, следует заменить его феноловым красным или бромкрезоловым пурпурным.

Для осуществления теста пробирки с полужидкой средой, содержащей углеводы, помещают на несколько минут в кипящую водяную баню для удаления большей части растворенного кислорода, затем их быстро охлаждают и столбики среды инокулируют микробиологической петлей. После инокуляции среду в одной из пробирок покрывают слоем 10 мм стерильного минерального масла (так называемая «анаэробная» пробирка). Среду во второй пробирке ничем не покрывают («аэробная» пробирка). Для выявления неспецифических реакций готовят контрольные пробы: 1) инокулируют такую же среду, не содержащую углевода; 2) инкубируют стерильную среду с углеводом. Результаты интерпретируют следующим образом.

1. Если кислота образуется только в аэробной пробирке, то клетки катаболизируют углевод с использованием О₂ (реакция О). В этой пробирке рост должен быть заметным.

2. Если подкисление происходит и в аэробной и в анаэробной пробирках, то клетки способны также к брожению (реакция F). Рост должен быть заметен в обеих пробирках.

3. Если кислота не образуется ни в одной пробирке, то клетки не способны катаболизировать углевод. Если рост отсутствует, то возможно, что в среде нет какого-либо питательного вещества, необходимого для роста изучаемого организма.

Примеры: реакция F с глюкозой проявляется стафилококком (St. epidermidis), реакция О с глюкозой — микрококком (М. varians). Отрицательный результат с глюкозой характерен для Ps. lemoighei.