2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках

Ионы кальция обладают интегрирующей функцией, его называют мультифункциональным мессенджером, влияющим на глобальные внутриклеточные процессы (Williams, 1988). Им принадлежит важная роль в обонятельной трансдукции ( Winegar et al., 1988; Menini, 1999). Помимо генерации рецепторного потенциала в невозбудимых клетках с участием Са²⁺ включается активность киназ, фосфатаз, ионных насосов, активация митохондрий и внутриклеточных сигнальных систем (Sham, 1997). Ионы кальция контролируют фундаментальные клеточные функции (Drummond et al., 2000; Hajnoczky et al., 2000). Поэтому кальций может служить индикатором вовлечения того или иного сигнального пути в ответ на одоранты. Са²⁺ в качестве индикатора имеет преимущество, поскольку зонды для него и системы измерения гораздо более чувствительны, чем для любого другого клеточного параметра (Rizzuto et. al., 2000).

Зондом на мембраносвязанный кальций является хлортетрациклин (ХТЦ), с помощью которого можно изучать клеточные процессы в суспензиях изолированных органелл, на целых тканях и в клетках в составе тканей.

Изменения в мембранах, вызванные воздействием физических или химических факторов, которыми являются и одоранты, отражаются на интенсивности свечения этого зонда (Владимиров и др., 1978; Владимиров, Добрецов, 1980; Лисовский и др., 1984; Самойлов, 1985). Показано (Carvalho, Carvalho, 1977), что флуоресценция ХТЦ обусловлена связыванием кальция мембранами. Величина свободного кальция в цитозоле строго контролируется с помощью цитоплазаматических кальциевых буферов, механизмов, выводящих Са²⁺ из клетки и кальций-секвестрирующих систем. Посредством забуферивания связывается значительное количество этого иона (до нескольких мМ), оставляя менее 1 мкМ свободной фракции. Большое количество кальция связывается отрицательно заряженными головками фосфолипидов, а также низко- и высокоафинными связывающими протеинами, которые снижают концентрацию свободного кальция в субмикромолярной области (Cavagioni, 1989).

В основе использования хлортетрациклина лежит его способность резко увеличивать квантовый выход флуоресценции, попадая в гидрофобное окружение биологической мембраны. В присутствии кальция увеличивается сродство ХТЦ к мембране и квантовый выход его комплекса с ней. В результате обе эти причины вызывают усиление свечения. В присутствии Са²⁺ зонд практически полностью связан с мембраной. Известно, что хлортетрациклин проникает через плазмолемму. Оптимальную флуоресценцию комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ регистрировали при 25 мкМ концентрации хлортетрациклина (Carvalho, 1978).

Показано, что рост интенсивности флуоресценции идет параллельно с накоплением меченого кальция, входящего в клетку из внеклеточной среды (Dixon et al., 1984). Следовательно, интенсивность флуоресценции отражает процесс переноса ионов кальция через плазмолемму. При этом повышение концентрации цитозольного кальция приводит к увеличению содержания комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ с цитозольной стороны мембраны и увеличению количества связанной с ней флуоресцирующей формы (Поглазов и др., 1975). Следовательно, люминесцентное исследование живых тканей при помощи хлортетрациклина отображает динамику транспорта этого иона.

Однако по изменению кальций-аккумулирующей способности мембран можно оценивать не только транспорт Са²⁺ через плазмолемму, но и вовлечение каскада ферментативных реакций, связанных с активацией внутриклеточных сигнальных систем, поскольку их активность регулируется ионами кальция. Поэтому применение ХТЦ в качестве флуоресцентного зонда удовлетворяет решению той задачи, которая перед нами поставлена, а именно, определить по динамике мембрано-связанного кальция участие той или иной сигнальной системы в рецепции одорантов.

Для исследования кальций-аккумулирующей способности мембран рецепторных клеток обонятельную выстилку помещали в 25 мкМ раствор ХТЦ, приготовленный на растворе Рингера (рН 7,33), и инкубировали в течение 40 – 45 минут. Затем ее размещали на предметном стекле под объективом люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ – МП (рис.1). В нем источник света коллектором и линзой проецируется в плоскость апертурной диафрагмы, затем системой линз и светоделительной пластинки переносится в плоскость выходного зрачка объектива. Полевая диафрагма объективом проецируется в плоскость объекта. Из общего излучения источника с помощью светофильтра выделяется свет, возбуждающий люминесценцию. Для предохранения препаратов и светофильтров от нагрева ртутной лампой предусмотрена кювета, наполненная дистиллированной водой и служащая теплозащитным фильтром. Светоделительная пластинка («зеленая») отражает 360 – 440 нм и пропускает 480 – 700 нм, что необходимо для исследования флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ.

Флуоресценцию комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ возбуждали ртутной лампой сверхвысокого давления ДРШ-250 М, имеющей высокую яркость и хорошую стабильность свечения (колебание светового потока излучения не превышает около 1%) и работающей на постоянном токе.

Для выделения возбуждающей флуоресценцию длины волны с максимумом на 390 нм применяли светофильтры СС и СЗС. Интенсивность флуоресценции регистрировали на длине волны 520 нм. Через препарат обеспечивали проток ХТЦ, покрывающий обонятельный бугорок тонким слоем, чтобы не препятствовать диффузии одорантов к рецепторным клеткам.

Световой сигнал от обонятельной выстилки поступал на фотоэлектронный умножитель, затем, через аналого-цифровой преобразователь, – в компьютер.