1.2. Строение обонятельных клеток

В обонятельных клетках выделяют четыре основных морфофункциональных отдела – вершину, периферический отросток, тело клетки и центральный отросток. Периферический отросток достаточно тонок, на всем протяжении содержит микротрубочки, митохондрии, аппарат Гольджи и вакуоли. На вершине он образует утолщение – булаву, снабженную жгутиками и представляющую собой один из важнейших метаболических центров обонятельного рецептора. Рецепторные клетки земноводных, как и всех позвоночных, относятся к рецепторам жгутикового типа (Бронштейн, 1966; 1977).

Различают три разновидности жгутиков, покрывающих поверхность обонятельных клеток: короткие и тонкие (20 – 30 мкм в длину), такой же длины, но более толстые, содержащие от 2 до 8 жгутиков, заключенных в общую плазмолемму, и длинные (50 – 200 мкм), утончающиеся к вершине.

Все три разновидности этих образований в проксимальном отделе содержат набор из 9х2+2 микротрубочек, которые начинаются в цитоплазме булавы от базального тельца, снабженного ножкой, спицеобразными выростами и поперечно-исчерченным корешком. Такой набор ультраструктур характерен для всех локомоторных ресничек и жгутиков и обеспечивает регуляцию их движений (Винников, 1971; Бронштейн, 1977; Matsuzaki et al., 1999).

3. Механизмы обонятельной трансдукции

Согласно современной теории обоняния восприятие запахов различного качества начинается с взаимодействия молекулы пахучего вещества с мембранным рецептором (Ronnet, Payne, 1995).

1. Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов

Анализ аминокислотной последовательности показывает, что обонятельные рецепторы принадлежат к первому семейству (классу А) рецепторов, сопряженных с G-белком, который включает в свой состав рецепторы к опсину и катехоламинам. Их называют также серпантинными рецепторами. Их полипептидная цепь 7 раз пронизывает мембрану и имеет внеклеточные и внутриклеточные петли. Лиганд-связывающий домен формируется внеклеточными петлями рецептора. Конформационные изменения, вызванные образованием лиганд-рецепторного комплекса, позволяют внутриклеточным петлям взаимодействовать и связываться с G-белком (Eyster, 1998).

Обонятельные рецепторы кодируются мультигенным семейством, не имеющим себе равного по размерам и разнообразию. Ген обонятельного рецептора человека был впервые идентифицирован в 1992 году. Детально охарактеризовано несколько их кластеров, а у некоторых геномных областей полностью определена акминокислотная последовательность. Идентифицированы 44 области, разбросанные по 13 хромосомам, 33 из них содержат последовательности, которые перекрываются с одной или более геномной областью. Вероятно, дубликации большого масштаба формируют существующий репертуар генов обонятельных рецепторов. Поэтому, по-видимому, обонятельных рецепторов больше, чем всех других известных сопряженных с G-белком рецепторных молекул, вместе взятых, что согласуется с их способностью распознавать широкую область структурно разнообразных пахучих лигандов (Sulivan et al., 1990; Buck, Axel, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Mombaerts, 1999). Гены рецепторных молекул для одорантов обнаружены у насекомых, рыб, амфибий, птиц и млекопитающих, что говорит о том, что они имеют высокую степень гомологии и хорошо сохранились у всех видов (Dikielny et al., 1994; Ressler et al., 1994; Sulivan et al., 1995; Clyne et al.,1999; Dryer, Berghard, 1999; Kutsukake et al., 2000).

Существует гипотеза, согласно которой область между вторым и шестым трансмембранными доменами обонятельного рецептора образует карман (pocket) для связывания с лигандом. Семейство генов кодирует синтез обонятельных рецепторных молекул у млекопитающих, обладающих значительным разнообразием аминокислотных последовательностей внутри этой предполагаемой зоны связывания, чем, вероятно, обусловлено такое разнообразие рецепторов (Shepherd, 1991; Dryer, Berghard, 1999; Mombaerts, 1999). Гены обонятельных рецепторов по способности образовывать друг с другом гибриды группируют в субсемейства. Члены одного и того же субсемейства кодируют рецепторы, гомологичные по аминокислотной последовательности и поэтому могут распознавать один и тот же или сходный одорант (Ressler et al., 1994).

Согласно стереохимической теории обоняния, молекула пахучего вещества должна взаимодействовать с активным центром молекулярного обонятельного рецептора, имеющего соответствующую этой молекуле стереоструктуру.

При картировании специфических протеинов на препаратах изолированных ольфаторных жгутиков был обнаружен гликопротеин с молекулярной массой 95 кДа (gp95) и плотностью распределения по поверхности мембран жгутиков обонятельных клеток 10 – 20 тысяч молекул на 1 мкм² (Chen, Lancet, 1984). Он является кандидатом на роль обонятельного рецептора. Этот протеин является тканеспецифичным и обнаруживается только в ольфакторном эпителии, а в нем - в жгутиковой мембране (Chen, Lancet, 1984; Chen, Pace, 1986; Lancet, 1986; Boyle et al., 1987; Lancet, 1987; Menco, Farbman, 1992). Методом in situ гибридизации показано, что обонятельные рецепторы экспрессируются в обонятельных клетках на ранней стадии развития (Е12), независимо от созревания клетки, когда периферический отросток еще не прорастает к апикальной поверхности обонятельной клетки, и присутствуют в ней задолго до возникновения детекции запаха. Экспрессия генов обонятельных рецепторов у этих животных обнаруживается между Е12-Е14 у крыс и Е13 – Е13,5 – у мышей (Saito et al., 1998). Картированы 16 генов, кодирующих синтез предполагаемых ольфакторных рецепторов человека. Эти гены состоят из 4 субсемейств, причем два из них являются псевдогенами (Ben-Arie et al., 1994; Mombaert, 1999). У крыс обнаружен ген (OR37), кодирующий синтез ольфакторного белка (Strotmann et al., 1992).

В различных экспериментах показано, что у обонятельных клеток нет специфичности к одоранту данного качества, и рецепторные клетки способны воспринимать несколько разных запахов (Moulton, 1976; Шеперд, 1987). Полагают, что в одной обонятельной клетке может экспрессироваться по крайней мере 2 типа рецепторов (Kashiwayanagi, Kurihara, 1994). По мнению G.M.Shepherd and S.Firestein (1991), обонятельная клетка экспрессирует единичный тип рецепторов, но с разной степенью сродства к разным лигандам. Наконец, существует мнение, согласно которому рецепторная клетка ольфакторного эпителия может обладать широкой чувствительностью к одорантам. При этом каждая из них экспрессирует несколько молекулярных рецепторных молекул данного субсемейства. Таким образом, спектр качественных ответов является суммой отдельных рецептивных полей данной обонятельной клетки. Причем на уровне одиночной клетки не только категории обонятельных рецепторов и их специфичность могут различаться, но и их сродство к молекулам одорантов. Таким образом, у позвоночных (крыс и амфибий) на клеточном уровне процесс связывания с молекулярным рецептором приводит в результате к активации множества обонятельных клеток с частично перекрывающимися профилями настройки (Duchamp-Viret et al., 1999).

Считают, что способность людей со специфической аносмией при некоторых условиях ощущать запахи обусловлена возможностью одного молекулярного рецептора обонятельных клеток взаимодействовать с разными пахучими веществами. Известно, что этот тип аносмии проявляется только при низких концентрациях одорантов, а при более высоких их концентрациях в рецепцию могут вовлекаться другие рецепторы, имеющие более низкое сродство к лиганду. Такое свойство рецепторных молекул обонятельной выстилки человека связывают с небольшим числом генов в геноме человека (около 500) по сравнению с числом воспринимаемых им одорантов (около 5000) (Ressler et al., 1994).

Однако беспрецедентный размер и разнообразие семейства обонятельных рецепторов свидетельствует о том, что каждый из них может быть высокоспецифичным для одного или нескольких сходных одорантов, поскольку свойства для большого разнообразия молекулярных рецепторов различны: варьирует их сродство к лигандам, фармакологическая реактивность, связь с другими компонентами клеток (Этингоф, 1991).

Все больше накапливается данных в пользу гипотезы о том, что в одной обонятельной клетке экспрессируется один обонятельный рецептор для данного одоранта (Sengupta et al., 1994; Keverne, 1995; Mombaerts, 1996; Hudspeth, Tanaka, 1998; Clyne et al., 1999; Cunningham et al., 1999; Mombaerts, 1999; Smith, 1999). Исследования с помощью in situ гибридизации показали, что как у рыб, так и грызунов, ген каждого обонятельного рецептора экспрессируется в небольшой фракции обонятельных клеток. Три различных субсемейства генов для обонятельных рецепторов обнаружены только в 0,1 – 0,2% клеток (Ressler, 1994).

С этой гипотезой согласуются данные, полученные на изолированных обонятельных клетках тритона методом пэтч-клэмп, где показано, что из 1569 тестируемых клеток только 1,6% реагировали на лилиаль, а из 896 только 1,7% - на лираль. Из общего числа рецепторных клеток обонятельного эпителия клетки, чувствительные к лиралю и лилиалю, занимают около 2% (Takeuchi, Кurahashi, 2003). Доказательством этого предположения являются также данные, полученные на ольфакторных клетках зебрафиш. Методом иммунного анализа было показано, что в обонятельной выстилке идентифицируются широко рассеянные клетки, экспрессирующие один и тот же обонятельный рецептор и посылающие аксоны в одиночную идентифицированную гломерулу (Baier et al., 1994; Sulivan e al., 1995; Yokoi et al., 1995; Yilmaster-Hanke et al., 2000; Yu et al., 2004). Но они рассеяны по поверхности эпителия не случайным образом, а образуют пространственные группы (Baier et al., 1994; Carr et al., 1994). Обонятельные клетки, имеющие ген одного и того же рецептора, окружены сотнями обонятельных клеток с геном другого обонятельного рецептора.

Вместе с тем посредством иммунохимического, гистохимического и иммуногистологического анализа с помощью моноклональных антител, а также методом in situ гибридизации выявили важную закономерность, суть которой заключается в том, что в гломерулу проецируется аксон от обонятельной клетки, экспрессирующей специфический рецептор (Key, Akeson, 1993; Katon et al., 1993; Carr et al., 1994; Ressler et al., 1994;’ Vassar et al., 1994; Mori, 1995; Mori et al., 1999; Potter et al., 2001;). Следовательно, гломерула является представителем ольфакторных рецепторов. Для нее характерна высокая специфичность в организации ольфакторных проекций, а также функциональная специализация. Они представляют различные обонятельные рецепторы, занимающие определенные области, причем обонятельные рецепторы тесно вовлекаются в механизмы, которые формируют этот высоко репродуцируемый паттерн проекции. Полагают, что обонятельные рецепторы обеспечивают направление роста аксонов в обонятельную луковицу (Mombaerts, 1999; Strausfeld, Hildebrand, 1999; Yilmaster-Hanke et al., 2000).

Специфические рецепторы к одорантам выявлены как у насекомых, так и млекопитающих. В обонятельной выстилке крыс и лягушек обнаружен камфорный рецептор и получены его биохимические характеристики (Фесенко и др., 1978 а, б; Fesenko et al., 1979; Fesenko, 1989). Посредством регистрации электроантеннограммы у мотыльков, стимулируемых такими одорантами, как линалоол, нерол, смесями веществ из листа томата и другими одорантами, с применением специфического окрашивания люциферовым желтым обонятельных клеток, расположенных в определенной области антенны, показана их избирательная реакция на линалоол. Из других веществ только нерол, входящий в ту же группу монотерпеноидов, как и лоналоол, мог вызвать ответ в этих же клетках, но величина его составляла около 1% от реакции на линалоол (King et al., 2000).

От 16 точек обонятельного эпителия крыс отводили электроольфактограмму (ЭОГ). По каждой группе животных составляли топографические карты ответов. Эксперименты показали, что для разных запахов эти карты отличались и были схожими для одного и того же запаха у разных особей (Mackay-Sim, Kesteven, 1994)

У лягушек с помощью стеклянных микроэлектродов регистрировали электроольфактограмму от 121 точки обонятельной выстилки. Стимулами служили 20 различных одорантов, в том числе камфора, бутанол, ментол, кумарин и другие. В опытах была выявлена корреляция между амплитудой локальных ответов ЭОГ и плотностью обонятельных рецепторов в точке регистрации. Оказалось, что чувствительность к одоранту определялась местом регистрации электроольфактограммы, причем топографическое распределение локальных ответов, вызываемых 20 пахучими веществами, различались у разных животных (Daval et al., 1980).

Следовательно, на поверхности обонятельного эпителия рецепторные клетки образуют «пространственные карты запахов». У рыб обонятельные клетки с одинаковым обонятельным рецептором случайным образом распределяются по всему обонятельному эпителию. У грызунов экспрессия семейства рецепторных молекул подразделяется на различные не перекрывающиеся пространственные зоны, которых у мышей насчитывается четыре (Ressler et al., 1994; Sullivan et al., 1995). В каждой из зон ольфакторный рецептор может взаимодействовать со своим лигандом, а клетки объединяются в группы по рецепторам со сходной лигандной специфичностью. Методами генетического анализа при гибридизации in situ с использованием зондов, специфических к обонятельным рецепторам, в эпителии носа крысы были топологически идентифицированы обонятельные клетки, специфически экспрессирующие определенный подтип мембранного рецептора (Breer et al., 1993).

Таким образом, обонятельный эпителий представляет собой мозаику обонятельных рецепторов, реагирующих на различные одоранты. При этом обонятельные жгутики разных клеток могут перекрываться. Поэтому в пределах одной зоны цилиарная сеть может содержать сложный ассортимент обонятельных рецепторов, принадлежащих различным обонятельным жгутикам.

Н.Saito et al. (1998) клонировали обонятельные рецепторы у мышей и выявили три их типа. Каждый тип рецепторной молекулы образует характерный пространственный паттерн, расположенный в одной из четырех различных пространственно разделенных зон. Так, обонятельные рецепторы 18A и V5 у мыши экспрессируются в обонятельных клетках зоны I и II, соответственно, а обонятельный рецептор V1- в I, II, III зоны.

Таким образом, в ольфакторном эпителии млекопитающих и амфибий установлены “молекулярные карты”, в которых обонятельные клетки локализуются в соответствии с молекулярным рецептором к специфическому одоранту, способным различать одоранты по размерам молекул (Polak et al., 1989). Наличие пространственных зон экспрессии генов обонятельных рецепторов указывает на то, что сенсорная информация до передачи ее в мозг организована в периферическом отделе, поскольку определенной зоной ограничены рецепторные клетки, реагирующие на один и тот же пахучий стимул. В ходе своего развития обонятельная клетка, как полагают, отбирает один рецепторный ген из 500 – 1000 возможных в соответствии с теорией вероятности (Sullivan et al., 1995).

Сравнительно недавно проведены исследования, посвященные идентификации белковых молекул, специфически взаимодействующих с определенным одорантом. В работе Tauhara K. et al. (1999) посредством сочетания изображения флуоресценции внутриклеточного Са²⁺ и PCR-анализа, связанного с обратимой транскрипцией, показали, что обонятельный рецептор «распознает» специфические структурные области в пределах молекулы одоранта. Таким образом, одиночная обонятельная клетка экспрессирует только один молекулярный рецептор. Авторы работы клонировали ген MOR23 для обонятельного рецептора к лиралю и проследили весь механизм трансдукции этого одоранта у мышей. Кроме гена MOR23, ими клонировано еще 15 других рецепторных генов из той части 220 клеток, которая реагировала на эвгенол, крезол и этилванилин.

Биологически значимым раздражителем для рыб являются аминокислоты (Hara, 1978; Кружалов, 1980; Johnstoun, 1980). В рецепторных клетках золотой рыбки охарактеризован мембранный рецептор (R5.24), который взаимодействует только с аргинином основной (катионной) аминокислотой. При этом к нейтральным алифатическим аминокислотам сродство этого рецептора было в 5 – 75 раз, а к кислым (анионным) аминокислотам – в 80 – 300 раз меньше. Такую высокую специфичность рецептора к аргинину авторы связывают со специфической длиной карбоновой R-группы, которая может отличаться на один атом углерода (Speca et al., 1999).

У крыс ген OR37 для специфического мембранного рецептора выявлен в определенных группах клеток, которые локализованы в ограниченных областях обонятельного эпителия (Strotmann et al., 1992). У нематод биохимическими, генетическими и поведенческими методами охарактеризован обонятельный рецептор ODR-10 к диацетилу, который кодируется геном odr-10 (Troemel et al., 1997).

В обонятельных клетках мышей идентифицирован рецепторный белок S25, сопряженный с ГТФ-связывающим белком, который из 24 одорантов, принадлежащих алифатическим спиртам, карбоксильным кислотам, дикарбоксильным кислотам и бомкарбоксильным кислотам, содержащим от 4 до 9 атомов углерода, взаимодействовал только с гексанолом и гептанолом (Floriano et al., 2000). Распознавание молекулы пахучего вещества обонятельным рецептором осуществляется по определенной функциональной группе, входящей в состав одорантов.

Методом PCR-анализа и in situ-гибридизации показано, что уже на очень ранних стадиях эмбриогенеза обонятельные рецепторы экспрессируются в соответствующих зонах ольфакторного эпителия. Полагают, что ранняя экспрессия молекулярных рецепторов играет важную роль в создании “карты обонятельных рецепторов” (Saito et al., 1998). При этом одно субсемейство рецепторных молекул экспрессируется только в 0,1 – 0,5% всех обонятельных клеток. Такая специфичность определяется тем, что только одна из двух аллелей гена каждого рецептора экспрессируется в одной обонятельной клетке. Это и приводит к тому, что в одной рецепторной клетке локализуется только один вид молекулярного рецептора (Chess et al., 1994; Griff, Reed, 1995). Таким образом, кодирование информации о качестве одоранта происходит уже в пространственном распределении молекулярных рецепторов (Mackay-Sim, Kesteven, 1994). При этом трансдукция возможна только в зрелых клетках, поскольку только в них созданы условия для встраивания в плазмолемму белка, образующего рецепторную молекулу (Cunningham et al., 1999; Dryer et al., 1999).

Итак, в мембранах обонятельных клеток обнаружены белковые молекулы, играющие роль мембранных рецепторов, взаимодействующих с одорантом. Считается, что рецепторы к одорантам принадлежат семейству G-белоксопряженных мембраносвязанных протеинов (Firestein, Shepherd, 1992).

Исходя из данных электрофизиологических исследований, проведенных на изолированной обонятельной выстилке или на изолированных рецепторных клетках, рецепторы одорантов локализуются в жгутиковом аппарате, поскольку реакции на одоранты регистрировались только при условии их целостности (Минор, Сакина, 1973; Firestein et al., 1990).