3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата

Стимуляция обонятельной выстилки амилацетатом, обладающим фруктовым ароматом (n=31), приводила к усилению флуоресценции (рис. 33). Амплитуда ответа в среднем на 64 отн. ед. превышала исходный уровень и достигала его через 6,2 с, а через 16,9 с сигнал возвращался к исходному уровню. Следовательно, амилацетат увеличивает кальций-аккумулирующую способность клеточных мембран обонятельных клеток.

На рис. 34 представлены данные, в которых реакция на стимул (n=6) регистрировалась при наличии в среде 2 мМ раствора ЭГТА. Как оказалось, при удалении кальция из омывающего раствора реакция на одорант исчезала. Следовательно, в ответ на стимуляцию амилацетатом вовлекается внеклеточный кальций.

Для выявления участия аденилатциклазы в реакции на амилацетат обонятельную выстилку обрабатывали 2,5-дидеоксиаденозином (n=12), и на этом фоне обдували амилацетатом. Как видно из рис. 35, реакции на стимуляцию амилацетатом не было. Таким образом, ингибирование аденилатциклазы приводило к исчезновению ответа на одорант. Это означает, что рост кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток при обдувании амилацетатом обусловливается активностью аденилатциклазы.

Для выявления возможной роли G-белка в генерации Са²⁺-сигналов, индуцированных амилацетатом, обонятельную выстилку обрабатывали фторалюминатом (AlF₄^-) и регистрировали реакцию на него, а также на одорант в его присутствии (n=11). Чтобы получить фторалюминат, на препарат апплицировали 50 мкМ раствора хлористого алюминия и 10 мМ раствора фтористого натрия. Данные, представленные на рис. 36, показывают, что добавление смеси этих солей вызывало повышение интенсивности флуоресценции, сходное с действием одоранта. Подобие реакций, возникающих на стимуляцию пахучим веществом и AlF₄^-, свидетельствует, очевидно, об аналогии механизмов их влияния на люминесценцию. Усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ под действием амилацетата можно объяснить активацией G-белка.

На стимуляцию амилацетатом на фоне AlF₄^- (n=11) в 64% случаев обонятельные клетки не реагировали (рис. 37), а в 36% их ответ был значительно снижен. Эти данные можно объяснить, вероятно, насыщением системы трансдукции, вызванным активацией одного из ее компонентов – ГТФ-связывающего белка, в результате чего блокируется вход Са²⁺ в цитозоль, а это служит еще одним свидетельством в пользу того, что повышение интенсивности флуоресценции в ответ на амилацетат обусловливается активацией G-белка.

Как было нами показано, в реакции на амилацетат участвует внеклеточный кальций. Вход его в клетку из окружающей среды возможен только через Са²⁺-каналы в плазмолемме. Их участие мы исследовали с помощью дилтиазема – блокатора Са²⁺-каналов, открываемых цАМФ. На рис. 38 приведены результаты влияния блокирования циклонуклеотид-регилируемых Са⁺-каналов (n=6) на динамику флуоресценции, индуцируемой амилацетатом в обонятельных клетках. Видно, что блокирование пути входа кальция полностью подавляло ответ на одорант. Следовательно, интенсивность флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ усиливалась под действием амилацетата благодаря входу ионов кальция через каналы, регулируемые цАМФ.

Вместе с тем известно, что ионные каналы могут регулироваться протеинкиназами. Чтобы проверить предположение об участии в реакции на амилацетат прортеинкиназы А, обонятельную выстилку инкубировали в Н-7 – ингибиторе ПКА и ПКС. Оказалось, что если выключить эти ферменты и стимулировать обонятельную выстилку амилацетатом (n=7), то реакция на стимул такая же, как и без Н-7 (Рис. 39). Это свидетельствует о том, что изменение флуоресценции, индуцируемое амилацетатом, не обусловливается активацией протеинкиназы А. Следовательно, не с этим ферментом связано открывание Са²⁺-каналов в плазмолемме обонятельных жгутиков под действием амилацетата.

Таким образом, из полученных результатов можно заключить, что амилацетат, обладающий фруктовым запахом, вовлекает в реакцию систему цАМФ, сопряженную с активацией аденилатциклазы и G-белка.