- •Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)
- •Строение органа обоняния
- •1.2. Строение обонятельных клеток
- •Механизмы обонятельной трансдукции
- •Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- •1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАмф в рецепции одорантов
- •1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
- •1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов
- •1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
- •1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
- •1.3.5.2. Участие протеинкиназы с в обонятельной трансдукции
- •Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции
- •1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков
- •1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1. Объект исследования
- •2.2. Методы люминесцентной микроскопии
- •2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- •2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток
- •2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
- •2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
- •2.4. Электроольфактография
- •2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки
- •2.6. Фармакологический анализ
- •Глава 3. Результаты исследований
- •3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов
- •3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- •3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры
- •3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола
- •3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата
- •3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина
- •3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака
- •3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
- •3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
- •3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков
- •3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков
- •Глава 4. Обсуждение результатов
- •4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
- •4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
- •4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий
- •4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •Заключение
- •Список литературы
1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
Известно, что циклический аденозинмонофосфат может образовываться двумя путями: либо в результате ингибирования фосфодиэстеразы, либо при гидролизе АТФ с участием аденилатциклазы (АЦ). Известно, что синтез цАМФ через активацию АЦ является самым консервативным энзиматическим процессом в клетках различных животных. Считают (Kurihara, Koyama, 1972; Lowe et al., 1989; Bakalyar, Reed, 1990)), что именно АЦ является ключевым ферментом синтеза циклического аденозинмонофосфата в обонянии. Установлен ряд фактов в подтверждение этого предположения.
Выявлена высокая активность аденилатциклазы в обонятельном эпителии быка по сравнению с другими тканями (Kurihara, Koyama, 1972). Так, в препаратах обонятельных жгутиков АЦ в 10 раз более активна, чем в мозге (Pace et al., 1985), что, очевидно, определяется высокой (на два порядка больше, чем в тканях мозга) концентрацией этого фермента в обонятельных клетках (Pfeuffer et al., 1989).
Показано, что аденилатциклаза, выделенная из обонятельной выстилки, специфически активируется такими одорантами, как амилацетат, цинеол, изоамилацетат, изобутилилпиперазин (Lancet, 1987). Концентрации перечисленных одорантов, вызывающих активирование АЦ и изменение электроольфактограммы, оказались одинаковыми, а на фоне форсколина ответ ЭОГ на одоранты заметно ослаблялся, что связывают с насыщением системы трансдукции (Минор, 1980; Lancet, 1987; Lowe et al., 1989; Frings, Lindemann, 1991). Различными авторами проводились электрофизиологические исследования посредством внеклеточных и внутриклеточных отведений от целостного эпителия и от отдельных клеток, находящихся в его составе (Минор, 1980; Frings, Lindemann, 1991; Frings et al., 1992). В других работах электрическую активность регистрировали от одиночных каналов изолированных обонятельных клеток (Firestein et al.,. 1991; Zufall et al., 1991). При этом сравнивали реакции рецепторных клеток на одоранты, действующие через систему цАМФ, с реакциями этих клеток на химические вещества, повышающие содержание циклонуклеотида в цитозоле. Применяли форсколин, проникающие аналоги цАМФ, ингибиторы аденилатциклазы и фосфодиэстеразы . и показали, что ответы на одоранты и применяемы агенты были сходны. Из этого был сделан вывод о том, что основная роль в механизме обонятельной тансдукции принадлежит аденилатциклазе.
Известно, что этот фермент катализирует превращение АТФ в цАМФ. Она обнаружена во всех типах клеток. В настоящее время клонировано 8 ее изоформ, специфичных для разных тканей.
Показано, что аденилатциклаза, регулируемая внеклеточными сигналами через ГТФ-связыващие протеины, является высоко консервативной структурой – от насекомых до млекопитающих. Она представляет собой интегральный белок, полипептидная цепь которого имеет 12 гидрофобных доменов, объединенных в две группы по шесть в каждом. Между этими группами доменов вставлен со стороны цитоплазмы фрагмент полипептидной цепи с молекулярной массой в 43 кДа, включающий два АТФ-связывающих домена (Авдонин, Ткачук, 1994; Eyster, 1998; Iorgenko, Levin, 2000; Крутецкая и др., 2003).
В обонятельном эпителии методом клонирования выделена специфическая для него изоформа АЦ III (Bakalyar et a., 1990; Menco et al., 1992). С помощью моноклональных антител ВВС-2 ольфакторную аденилатциклазу идентифицировали и показали, что она представляет собой пептид с молекулярной массой 180 кДа, принадлежащий семейству G-белок-чувствительных аденилатциклаз (Iorgenco, Levin, 2000). Методом PCR-анализа и in situ-гибридизации показано, что эта аденилатциклаза появляется в раннем эмбриональном периоде (Е15), после того как образованы обонятельные жгутики (Е13) и экспрессированы обонятельные рецепторы. Оказалось, что АЦ III в ходе эмбриогенеза появляется только на уровне эпителиальной поверхности и никогда не распространяется ниже слоя обонятельных жгутиков. Кроме того, оказалось, что специфическая для обонятельного эпителия аденилатциклаза не экспрессируется в микровиллах опорных клеток, а в обонятельных находится преимущественно в дистальных, тонких, отделах обонятельных жгутиков. Такая ее локализация сохраняется и у взрослых животных, а также в ходе регенерации эпителия после бульбоэктомии (Pace, Lancet, 1985; Pfeuffer et al., 1989; Bakalayer et al., 1990; Menco et al., 1992; Saito et al., 1998; Sinnaraja et al., 1998; Mutsuzaki et al., 1999). Таким образом, участие аденилатциклазы в рецепции пахучих веществ и ее локализация в жгутиках обонятельных клеток доказаны.