3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина

На рис. 40 а представлены данные по изменению флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ при стимуляции обонятельной выстилки ванилином, обладающим цветочным запахом. Видно, что в ответ на одорант интенсивность свечения увеличивалась (n=38). Амплитуда сигнала примерно через 20 с достигала 100 отн. ед., а затем свечение угасало, возвращаясь к исходному уровню через 40 с. С этим ответом коррелировала ЭОГ (рис. 40 б).

Под действием одоранта на фоне 2 мМ раствора ЭГТА (n=10) реакция на ванилин исчезала (рис. 41), что свидетельствует об участии внеклеточного кальция в инициации ответа на ванилин.

Роль аденилатциклазы в усилении светового сигнала, возникающего под действием одоранта, изучали с помощью ингибитора этого фермента – 2,5-дидеоксиаденозина (n=10). Из данных, представленных на рис. 42, видно, что при ингибировании фермента реакция на ванилин сохранялась. Следовательно, повышение флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ обонятельных клеток не обусловливается активацией аденилатциклазы.

Мы предположили, что в реакцию на этот одорант может вовлекаться фосфоинозитидный путь. Чтобы проверить это предположение, обонятельную выстилку в течение 5 – 7 минут инкубировали в неомицине, а затем обдували ванилином (n=6). Оказалось, что ингибирование фосфолипазы С, основного фермента фосфоинозитидной сигнальной системы, полностью подавляло одорант-индуцируемое повышение интенсивности флуоресценции (рис. 43). Это означает, что изменение светового сигнала, иницируемое ванилином, связано с активацией ФЛС.

Фосфолипаза С, как известно, может стимулироваться сопряженным с ней G-белком. Чтобы проверить такой вариант объяснения механизма активации фосфолипазы С в исследуемых рецепторах, мы апплицировали на обонятельную выстилку смесь 50 мкМ раствора AlCl₃ и 10 мМ раствора NaF (n=6) и регистрировали реакцию на воздействие этой смеси. Данные, представленные на рис. 44, показывают, что фторалюминат вызывал повышение флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, подобное индуцированному одорантом, но длящееся значительно дольше. Сходство реакций свидетельствует об участии ГТФ-связывающего белка в инициации ответа на ванилин. В то же время стимуляция обонятельной выстилки ванилином на фоне фтористого алюминия приводит к значительному или даже полному подавлению ответа обонятельных клеток на ванилин (рис. 45), что связано с насыщением системы трансдукции и полным прекращением входа кальция в клетки (Крутецкая и др., 2003). Это подавляющее влияние на флуоресцентный сигнал является дополнительным доказательством участия ГТФ-связывающего белка в реакции на ванилин.

Известно, что в невозбудимых клетках, к которым относятся обонятельные, кальций входит по лиганд-управляемым каналам. Мы предположили, что ими могут быть каналы, управляемые IP₃, так как ключевым ферментом в реакции с ванилином является фосфолипаза С, гидролизующая мембранные фосфолипиды, повышая содержание IP₃ в клетке. На рис. 46 представлены результаты, полученные при обдувании обонятельной выстилки ванилином на фоне рутениевого красного (n=10), который блокирует Са²⁺-каналы в плазмолемме, открываемые 1,4,5-трифосфоинозитидом. Видно, что на фоне блокатора Са²⁺-каналов реакция на ванилин полностью исчезала. Это означает, что усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, связанное со стимуляцией одорантом, обусловливалось входом ионов кальция по каналам, регулируемым IP₃.

Участие протеинкиназы С в реакции на ванилин мы исследовали с помощью соединения Н-7 (n=6). Для этого обонятельную выстилку инкубировали в течение 5 – 7 минут в Н-7, а затем стимулировали ванилином. На рис. 47 показано, что ингибирование протеинкиназы С не влияло на усиление флуоресценции, индуцируемое одорантом. Следовательно, кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток не зависит от активности этого фермента.

Таким образом, в реакции обонятельной выстилки на ванилин участвует фосфоинозитидная сигнальная система. Синтез IP₃ для его участия в качестве вторичного посредника реакций обонятельных рецепторов на ванилин катализируется фосфолипазой С, активируемой G-белком.

Следует отметить, что амиловый спирт, обладающий прогорклым запахом, камфору – камфорным, цинеол – эвкалиптовым, амилацетат, имеющий фруктовый запах, и ванилин, обладающий цветочным ароматом, мы включили в первую группу одорантов.