- •Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)
- •Строение органа обоняния
- •1.2. Строение обонятельных клеток
- •Механизмы обонятельной трансдукции
- •Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- •1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАмф в рецепции одорантов
- •1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
- •1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов
- •1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
- •1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
- •1.3.5.2. Участие протеинкиназы с в обонятельной трансдукции
- •Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции
- •1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков
- •1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1. Объект исследования
- •2.2. Методы люминесцентной микроскопии
- •2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- •2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток
- •2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
- •2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
- •2.4. Электроольфактография
- •2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки
- •2.6. Фармакологический анализ
- •Глава 3. Результаты исследований
- •3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов
- •3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- •3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры
- •3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола
- •3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата
- •3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина
- •3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака
- •3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
- •3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
- •3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков
- •3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков
- •Глава 4. Обсуждение результатов
- •4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
- •4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
- •4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий
- •4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •Заключение
- •Список литературы
3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
Сероводород, обладающий гнилостным запахом, получали из бета-меркаптоэтанола.
На рис. 55 а представлены данные по изменению флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ при стимуляции обонятельной выстилки сероводородом (n=14). Предъявление стимула вызывало повышение интенсивности свечения в среднем на 50 отн. ед. от исходного уровня.
Флуоресцентный ответ на стимуляцию одорантом коррелировал с электрическим (рис. 55 б). Это означает, что в усилении флуоресценции, как и в электрической реакции, отображается функционирование рецепторных клеток.
Как показали результаты опытов с применением 2 мМ ЭГТА (n=14), стимуляция обонятельных клеток сероводородом на фоне ЭГТА инициировала такое же по величине усиление флуоресцентного сигнала, как и без него (рис. 56). Это означает, что реакция на одорант не зависит от наличия внеклеточного Са2+ , а в ней принимают участие ионы кальция, высвобождающиеся из внутриклеточных депо.
Мы предположили, что источником внутриклеточного кальция, могут быть митохондрии. Для проверки этого предположения использовали азид натрия, который специфически ингибирует терминальный участок митохондриальной дыхательной цепи.
В ходе эксперимента наблюдали за изменением флуоресценции под действием NaN3 (n=14) и при обдувании обонятельной выстилки одорантом после пяти минутной ее инкубации в азиде натрия (n=14).
Результаты исследования показали, что аппликация NaN3 на препарат приводила к такому же повышению интенсивности флуоресценции, как и H2S (рис. 57). Как видно, реакции на азид натрия и сероводород, сходны, что, вероятно, связано со сходством механизмов их действия. Следовательно, влияние сероводорода направлено на митохондрии обонятельных клеток.
Это предположение подтвердилось и при стимуляции препарата одорантом на фоне NaN3.. В 72% опытов реакции на H2S исчезали (рис. 58). Такой эффект можно, вероятно, объяснить тем, что, у сероводорода и азида натрия один и тот же источник поступления ионов кальция в цитозоль – митохондрии, запас которых полностью истощается при совместном действии этих двух агентов.
Сравнивая результаты исследований одорантов первой и второй групп, мы пришли к выводу о существовании принципиальных различий между ними в механизмах обоянтельной трансдукции. Стимуляция одорантами, обладающими цветочным, фруктовым, эвкалиптовым, камфорным и прогорклым запахами усиливают интенсивность флуоресценции обонятельных клеток, вовлекая в реакцию внутриклеточные сигнальные системы.
Вещества, имеющие острый и гнилостный запахи, также увеличивают интенсивность флуоресценции комплекса: Са2+ -ХТЦ-КМ, но реакция обеспечивается их непосредственным влиянием на митохондрии.
3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
Придя на основании косвенных данных к выводу о вовлечении митохондрий обонятельных клеток в реакции на одоранты, мы приступили к исследованию этого вопроса в опытах с непосредственной регистрацией параметров клеточного дыхания.
Уровень функциональной активности клеток тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. Многие раздражители, как физические, так и химические, стимулируют митохондриальные ферменты, усиливают окислительное фосфорилирование и таким образом активируют клеточное дыхание.
Влияние одорантов на активность дыхательной цепи митохондрий мы исследовали посредством анализа собственной флуоресценции восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) и окисленных флавопротеидов (ФП) в митохондриях обонятельных клетках.
Для ответа на вопрос – прямо или опосредованно пахучие вещества влияют на дыхание митохондрий, ингибировали аденилатциклазу или фосфолипазу С (ключевые ферменты цАМФ и фосфоинозитидной сигнальных систем, соответственно), а затем анализировали реакции на стимулирование обонятельной выстилки одорантами.