3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры

Обдувание обонятельной выстилки камфорой, принадлежащей группе одорантов с камфорным запахом, вызывало увеличение интенсивности флуоресценции в довольно большом диапазоне – от 45 до 370 отн. ед. (n=38). При этом время достижения максимального ответа не зависело от амплитуды ответа и варьировало от 3 до 5 с. Реакция на одорант длилась 20 – 25 с (рис.19 а). Следовательно, под влиянием камфоры кальций-аккумулирующая способность мембран обонятельных клеток увеличивалась.

Следует отметить, что было очень сложно обнаружить область обонятельной выстилки, чувствительную к этому одоранту. Такой факт может, вероятно, свидетельствовать о небольшом числе зон, в которых сосредоточены рецепторные клетки, воспринимающие камфорный запах.

На рис. 19 б видно, что при стимуляции обонятельного эпителия камфорой регистрируется отрицательный потенциал, который, как известно, генерируется рецепторными клетками. Максимальное значение его достигалось через 3 - 5 с после воздействия, а через 15 – 20 с он возвращался к изолинии. Сходная кинетка этих двух реакций указывает, вероятно, на то, что обе они характеризуют поведение рецепторных клеток.

Роль внеклеточного кальция мы определяли с помощью ЭГТА. Для этого обонятельную выстилку помещали в 2 мМ раствор ЭГТА, и на его фоне стимулировали рецепторные клетки камфорой. На рис. 20 видно, что в данных условиях реакции на стимул не было. Следовательно, в ответе на камфору принимают участие ионы кальция из внеклеточной среды.

Участие аденилатциклазы в реакции на камфору исследовали посредством стимуляции ольфакторного эпителия одорантом на фоне ее ингибитора – 2,5-дидеоксиаденозина (10 мкМ). При этом флуоресцентный сигнал под действием камфоры усиливался так же, как при действии одорантом на нативный препарат (n=5), но максимального значения достигал за 5 – 6 с и дольше возвращался к исходному уровню (рис.21). Это указывает на то, что в инициации реакции на камфору аденилатциклаза не участвует, но она может влиять на её кинетику.

Для выяснения роли цАМФ в механизме трансдукции камфоры мы применяли 100 мкМ раствор кофеина, который в данной концентрации ингибирует фосфодиэстеразу, в результате чего повышается содержание цАМФ в цитозоле. Мы предположили, что если в реакции на камфору участвует циклический аденозинмонофосфат, то на фоне кофеина реакции на стимул не будет.

Однако после пятиминутной инкубации обонятельной выстилки в 100 мкМ кофеине (n=5) обдувание ее камфорой усиливало желто-зеленое свечение (рис. 22). При этом амплитуда сигнала на 134 отн.ед. превышала уровень исходного сигнала, время достижения пикового уровня сокращалось до 3,6 с, а прекращалась реакция через 19 с. Таким образом, цАМФ не участвует в инициации реакции на камфору, но повышение его цитозольного содержания за счет ингибирования ФДЭ ускоряло ответ препарата на камфору, то есть оказывало влияние на кинетику реакции.

Таким образом, аденилатциклазный путь трансдукции сигнала не участвтует в механизме восприятия камфоры. Мы предположили, что им может быть фосфоинозитидный путь. Для подтверждения нашего предположения мы исследовали участие ПКС в реакции обонятельных клеток на камфору. Она является одним из основных ферментов этого пути передачи сигнала в клетках. Опыты проводили следующим образом. Обонятельную выстилку обрабатывали Н-7 (50 мкМ), а затем стимулировали одорантом.

Из данных, представленных на рис. 23, видно, что под действием камфоры на препарат, обработанный 50 мкМ раствором Н-7, ингибирующим ПКС, интенсивность флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ усиливалась (n=7). Максимальное значение реакции было таким же, как в нативном препарате, но она не возвращалась к исходному уровню даже в течение 1 минуты. Следовательно, без протеинкиназы С одорант способен инициировать изменение свечения, а фермент, вероятно, участвует в завершении ответа на камфору.

Если обонятельную выстилку инкубировали в рутениевом красном (30 мкМ), а затем на его фоне стимулировали камфорой (n=14), то реакция на одорант не регистрировалась (рис. 24). Рутениевый красный в клеточных и тканевых препаратах блокирует 1,4,5-трифосфоинозитид-регулируемые Са²⁺-каналы плазмолеммы, а не внутриклеточных депо, поскольку не проникает через нее в цитозоль. Отсутствие реакции на камфору после обработки обонятельной выстилки этим блокатором свидетельствует о том, что увеличение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток при их обдувании камфорой обусловливается, по-видимому, изменением проницаемости плазматической мембраны для Са²⁺, и этот процесс регулируется IP₃.

На рис. 25 представлены результаты исследования участия ГТФ-связывающего белка в реакции на камфору. Для этого обонятельную выстилку обрабатывали AlF₄^- и регистрировали реакцию на него. Оказалось, под воздействием фторалюмината (n=5) интенсивность флуоресценции не изменялась (рис. 25), тогда как при обдувании обонятельной выстилки камфорой в его присутствии в среде (рис. 26) она усиливалась так же, как и без него. Следовательно, активация G-белка посредством AlF₄^- не инициировала реакцию в обонятельных клетках, подобную той, которую вызывала в них камфора, и не влияла на параметры, характерные для ответа на камфору. Такой результат свидетельствует о том, что воздействие камфорой на обонятельные клетки не опосредуется ГТФ-связывающим протеином.

Однако известно, что активироватьт эффекторные белки в цепи передачи сигнала могут не только G-белки, но и тирозинкиназы. Вовлечение их в рецепцию камфоры исследовали с помощью их ингибитора 100 мкМ раствора генистейна (n=6). Для этого препарат сначала инкубировали в генистейне, а затем стимулировали камфорой. Оказалось, что при выключении этого фермента реакция на камфору не регистрировалась (рис. 27). Следовательно, способность клеточных мембран обонятельных клеток аккумулировать кальций под влиянием камфоры зависит от активности тирозинкиназ.

Таким образом, из полученных результатов видно, что в рецепцию камфоры включается фосфоинозитидная сигнальная система, сопряженная с функционированием тирозинкиназы.