- •Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)
- •Строение органа обоняния
- •1.2. Строение обонятельных клеток
- •Механизмы обонятельной трансдукции
- •Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- •1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАмф в рецепции одорантов
- •1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
- •1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов
- •1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
- •1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
- •1.3.5.2. Участие протеинкиназы с в обонятельной трансдукции
- •Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции
- •1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков
- •1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1. Объект исследования
- •2.2. Методы люминесцентной микроскопии
- •2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- •2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток
- •2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
- •2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
- •2.4. Электроольфактография
- •2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки
- •2.6. Фармакологический анализ
- •Глава 3. Результаты исследований
- •3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов
- •3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- •3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры
- •3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола
- •3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата
- •3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина
- •3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака
- •3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
- •3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
- •3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков
- •3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков
- •Глава 4. Обсуждение результатов
- •4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
- •4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
- •4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий
- •4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •Заключение
- •Список литературы
1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
Из вышесказанного следует, что основное внимание в большинстве исследований обонятельной рецепции уделено аденилатциклазному пути трансдукции. Идентифицированы и охарактеризованы основные компоненты этого пути, изучено большое разнообразие одрантов, вовлекающих АЦ в механизм их восприятия.
1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
Однако кроме системе цАМФ все большее внимание привлекает участие фосфоинозитидного пути в обонятельной трансдукции (Ronnet, Рayne, 1995). Первым звеном в механизме передачи сигнала в этом пути является гидролиз мембранных фосфолипидов посредством фосфолипазы С (ФЛС).
Выделено и охарактеризовано около 10 различных изоформ фосфолипазы С, которые различаются по молекулярной массе, зависимости от рН, изоэлектрической точке и другим свойствам. Все фосфолипазы делят на 4 основные группы (альфа, -бета, -гамма и –дельта), первичная структура которых отличается друг от друга по аминокислотной последовательности. Различные изоформы фосфолипазы С опосредуют действие разных классов агонистов. Так, например, ФЛС-бета активируется агонистами, рецепторы которых сопряжены с ГТФ-связывающими белками, а изоформа гамма-1 – действие факторов роста путем тирозинового фосфорилирования. В настоящее время клонированы и секвенированы гены изоформ фосфолипазы С – бета, гамма и дельта (Whitman, Cantley, 1988; Крутецкая, Лебедев, 1992 , а; Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и др., 2003).
Фосфолипаза С очень специфична в отношении фосфоинозитидов и не гидролизует фосфолипиды другого класса. Полагают, что взаимодействие изоформ ФЛС происходит не с липидным бислоем, а с мембранными белками, которыми могут быть ГТФ-связывающие белки или рецепторы агонистов. В результате их активации стимулируется фосфолипаза С - основной фермент фосфоинозитидного пути. Этот энзим катализирует расщепление мембранных фосфолипидов фосфотидилинозитол 4,5- бифосфатов до водорастворимого 1,4,5-инозитолтрифосфата (IP3) и мембрано-связанного диацилглицерола. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, а IP3 обеспечивает различные механизмы поступления Са2+ в цитозоль, который, в свою очередь, активирует клеточные процессы (Eyster, 1998; Крутецкая, Лебедев, 1992 а; Крутецкая и др., 2003).
На участие обмена фосфоинозитидов в обонятельной трансдукции указывают результаты экспериментов, проведенных на рецепторных клетках саламандры. Оказалось, что стимуляция их смесью из лираля-лилиаля-триэтиламина стимулирует фосфолипазу С, активность которой проявляется в цитозоле их обонятельных жгутиков. Из обонятельного эпителия сома выделено три изоформы этого фермента: с молекулярными массами 100.000, 82.000, 60.000. Этот энзим активируется вслед за связыванием рецептора с молекулой одоранта. Специфическим свойством ольфакторной ФЛС является гидролиз фосфоинозитидов с образованием IP3 (Boyle et al., 1987). Стимуляция рецепторных клеток рыб аланином и аргинином, специфическими для рыб одорантами, вызывала повышение содержания 1,4,5-инозитолтрифосфата (Boyle et al., 1987; Restrepo et al., 1992; Speca et al., 1999).
По мнению A.G. Boyle et al. (1987), взаимодействие аминокислот с рецептором стимулирует фосфоинозитидный сигнальный путь по механизму, сопряженному с Golf, то есть сигнал от ольфакторного рецептора на эффекторные системы клетки передается через ГТФ-cвязывающий белок.