4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий

О вовлечении митохондрий в реакции обонятельных клеток на аммиак и сероводород свидетельствуют исследования собственной флуоресценции НАДН и ФП.

Под действием аммиака она усиливалась, причем сильнее реагировали пиридиннуклеотиды, то есть увеличивалась степень их восстановленности. Известно, что высокая степень восстановленности никотинамидадениндинуклеотида в митохондриях является причиной блокирования цикла Кребса на уровне НАД-зависимых ферментов митохондриального матрикса: изоцитратдегидрогеназы, альфа-кетоглутаратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы (Лукьянова и др., 1982; Савина, 1992).

Действие ротенона на обонятельную выстилку выявило реакции, подобные аммиаку. Он, как и одорант, восстанавливал пиридиннуклеотиды и окислял или восстанавливал флавопротеиды. Как известно, ротенон является ингибитором окисления НАДН- и НАД-зависимых субстратов (пирувата, глутамата, альфа-кетоглутарата) и подавляет клеточное дыхание, блокируя перенос электронов с флавопротеидов на убихинон. Такое сходство ответов обонятельной выстилки на два разных агента, очевидно, говорит о том, что аммиак и ротенон обладают сходным механизмом действия: подобно ротенону, аммиак ингибирует клеточное дыхание и делает это непосредственно - без участия внутриклеточных сигнальных систем.

Показано (Szerb, Butterworth, 1992), что аммиак, будучи неполярным веществом, обладает липофильностью и хорошо проникает через мембраны. Вместе с тем известно, что действие нейтральных ароматических соединений, проникающих в гидрофобные участки дыхательной цепи митохондрий, направлено на нее, тогда как заряженные молекулы, неспособные проникнуть в гидрофобные участки электрон-транспортной цепи, преимущественно ингибируют дегидрогеназы субстратов (Ратникова, Ягужинский, 1972).

В.Г.Смирнова и соавторы (1972) исследовали вещества ароматического ряда, которые тормозят окисление митохондриями НАД-зависимых субстратов в присутствии акцептора фосфата (состояние 3). Они обнаружили, что местом действия этих ингибиторов является участок дыхательной цепи, расположенный между НАДН и цитохромом в. Эффект изученных веществ сходен по характеру с действием такого ингибитора, как ротенон. Оказалось, что чем выше растворимость вещества в липидах, тем эффективнее он действует в качестве ингибитора транспорта электронов. По мнению этих авторов, многие вещества, хорошо растворимые в жирах, при попадании в клетку в первую очередь должны специфически ингибировать окисление НАД-зависимых субстратов митохондриями.

Известно, что аммиак в виде NH₃.6H₂O (в таком виде он находится в нашатырном спирте, который являлся источником аммиака в наших опытах) легко проникает через плазматическую и митохондриальную мембраны. Совместными исследованиями химиков и физиологов показано, что аммоний является структурным хамелеоном – он существует в растворах, по меньшей мере, в виде трех соединений: четвертичного иона аммония, аммиака и аммиак-гидрата (Szerb, Butterworth, 1992). Два последних соединения, будучи неполярными, обладают липофильностью и хорошо проникают через мембраны. При увеличении концентрации аммония содержание липофильных форм возрастает.

При обдувании обонятельной выстилки аммиаком в обонятельной слизи, по-видимому, создается кратковременный избыток этого одоранта. Это означает, что над обонятельным эпителием повышается содержание гидрофобных аммонийных компонентов, проникающих в митохондрии. Четвертичный ион аммония не попадает в эти органеллы извне, поскольку их мембраны непроницаемы для NH₄⁺. Пройдя в митохондриальный матрикс, аммонийные соединения сохраняют свой структурный дуализм, а, следовательно, образуют и ион аммония.

Вероятно, с этим связано его двойное действие на окислительный метаболизм: с одной стороны, он ингибирует клеточное дыхание, подобно ротенону, проникая в гидрофобные участки дыхательной цепи, а с другой, – влияет на активность митохондриальных ферментов. Действительно, ион аммония подавляет активность НАДН-и НАД(Ф)Н-зависимой изоцитратдегидрогеназы, митохондриального альфа-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса при физиологических концентрациях, ингибирует ФАД-зависимые дегидрогеназы (Lai, Cooper, 1991; Венедиктова и др., 2001). Под влиянием аммиака в изолированных митохондриях мозга нарушается энергетический обмен, истощаются запасы АТФ, ингибируется Na⁺/Ca²⁺-обмен, блокируется захват Са²⁺ митоходриями, что, в свою очередь, инициирует накопление этого иона в цитозоле (Jessy et al., 1990; Косенко и др., 2001; Фелипо и др., 2001).Таким образом, в этих опытах продемонстрировано прямое действие аммиака на митохондрии.

Принимая во внимание эти свойства аммиака, можно предположить, что и в обонятельных клетках NH₃ проникает в гидрофобные участки дыхательной цепи митохондрий и действует на окислительный метаболизм, ингибируя активность дыхательной цепи митохондрий, подобно ротенону. С другой стороны, в виде иона аммония, образующегося в митохондриальном матриксе из проникшего туда аммиака, он ингибирует также дегидрогеназы субстратов. Кроме того, под влиянием аммиака в митохондриях нарушается энергетический обмен, блокируется захват кальция митохондриями.

Вероятно, повышение кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток под действием аммиака обусловливается ингибированием окислительного метаболизма в них, что сопровождается истощением митохондриального кальция и накоплением его в цитозоле.

Количество этого иона, связанного с внутренней мембранной поверхностью, коррелирует с аккумуляцией мембранами, как это показано на эритроцитах (Орлов, Шевченко, 1978). В свою очередь, содержание ионов кальция в этой области может варьировать вследствие изменения его внутриклеточной концентрации, изменения величины константы связывания кальция, изменения конформационного состояния мембраны и свойств микроокружения в зонах связывания Са²⁺, а также изменения числа участков связывания Са²⁺. На мембране эритроцитов ими являются карбоксильные группы белков, связывающие 60 - 70% мембранного кальция и локализованные в основном на внутренней стороне мембраны кислые фосфолипиды (Орлов, Шевченко, 1978). В свою очередь, в зависимости от состояния мембраны и изменений условий вне- и внутриклеточной среды количество типов и участков связывания Са²⁺ меняется, а тем самым изменяется общее содержание кальция в мембранах (Курский и др., 1977).

Важно отметить, что усиление интенсивности флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ под действием аммиака связано не только с увеличением концентрации внутриклеточного кальция, но и с изменением свойств плазмолеммы, поскольку показано, что он увеличивает степень ее поляризации и снижает текучесть, а следовательно, увеличивает ее жесткость (Kashiwaynagi, Kurihara, 1985).

Вероятно, с опустошением митохондриального кальциевого депо можно связать снижение или исчезновение реакции на одорант на фоне ротенона и FCCP. Известно, что FCCP блокирует захват Са²⁺ митохондриями. Под его действием этот ион высвобождается из них (Limmermann, 2000). Показано, что уже через 30 с после его аппликации концентрация кальция в цитозоле увеличивается за счет выхода из органелл (White, Reinolds, 1997). Поскольку аммиак сам приводит к высвобождению кальция из митохондрий, то суммарный его эффект с ингибитором клеточного дыхания и разобщителем окислительного метаболизма истощает запасы Са²⁺ в них. В результате при стимуляции NH₃ реакция снижается вплоть до исчезновения.

Таким образом, в отличие от одорантов первой группы, в обонятельную рецепцию аммиака не вовлекаются внутриклеточные сигнальные системы. Механизм его действия направлен непосредственно на митохондрии, по-видимому, в начальном участке дыхательной цепи – в области комплекса I.

Стимуляция обонятельной выстилки сероводородом вызывала либо небольшое нарастание интенсивности собственной флуоресценции НАДН, либо не изменяла ее. Одорант-зависимое окисление флавопротеидов при этом также было либо незначительным, либо не происходило вовсе. Реакции развивались очень медленно, достигая максимума более, чем за две минуты. Слабые реакции компонентов дыхательной цепи митохондрий на сероводород или отсутствие их может, вероятно, свидетельствовать о том, что под действием гнилостного запаха подавляется межмолекулярный транспорт электронов по дыхательной цепи.

Аналогичным влиянием обладает ингибитор терминального окисления – азид натрия, который, как и сероводород, повышает степень восстановленности пиридиннуклеотидов. Следовательно, выявлено определенное сходство в действии на клеточное дыхание азида натрия и H₂S. Меркаптан, подобно ингибиторам терминального участка дыхательной цепи, проникая в митохондрии, по-видимому, угнетает клеточное дыхание обонятельных клеток, действуя непосредственно. Однако складывается впечатление, что сероводород и азид натрия имеют разные пункты (“мишени”) действия в электрон-транспортной цепи митохондрий.

Как показали наши эксперименты, азид натрия, в отличие от одоранта, всегда изменяет окислительно-восстановительное состояние не только НАДН, но и ФП, что указывает на сохранение транспорта электронов между ними. Для ингибиторов терминального участка электрон-транспортной цепи митохондрий свойственно неполное угнетение клеточного дыхания. Так, 3 мМ цианистый калий в срезах печени на 70 - 80% угнетает окислительный метаболизм. При этом сохраняется остаточное дыхание, связанное главным образом с немитохондриальными системами окисления, такими как ферменты микросомального окисления, включая, цитохром Р450 (Лукьянова и др., 1982).

Что касается H₂S, то в 64% случаев обдувание им обонятельного эпителия прекращало электронный транспорт по дыхательной цепи. Приведенные данные свидетельствуют о том, что сероводород, в отличие от азида натрия, блокирует перенос возбужденных электронов не только на конечном, но и на начальном участке дыхательной цепи митохондрий.

Известно, что сероводород так же, как и аммиак, хорошо проникает через плазмолемму и внутреннюю мембрану митохондрий. Он является сильным дыхательным ядом, вызывающим тканевую аноксию вследствие блокады железо- и медьсодержащих ферментных систем. Поэтому считалось, что его действие направлено главным образом на терминальный участок дыхательной цепи митохондрий. Здесь локализуется цитохромоксидаза, переносящая электроны на О₂ с образованием воды. Она представляет собой интегральный белок внутренней митохондриальной мембраны. Функциональная единица фермента состоит из 4 одноэлектронных центров: двух гемов (в цитохроме а и цитохромоксидазе) и двух атомов Cu (Лукьянова и др., 1982). Сероводород за счет связывания с Cu в цитохромоксидазе блокирует перенос электронов на кислород. Но в составе цитохрома а и цитохромоксидазе присутствует железо, поэтому, вероятно, под действием H₂S электроны не могут перейти с одного цитохрома на другой (Reynafarje, Feffeira, 2002).

Однако есть все основания полагать, что действие сероворода на клеточное дыхание не ограничивается только цитохромоксидазой. Известно, что имеется два основных участка поступления восстановленных эквивалентов в дыхательную цепь от субстратов: НАД- и ФАД-зависимый. Местом входа электронов в митохондриальную электрон-транспортную цепь является НАДН-убихиноноксидоредуктаза (комплекс I). Это самый большой дыхательный комплекс с молекулярной массой более 900 кДа и в молекуле, идентифицированной у быка, состоит из 45 различных субъединиц. Комплекс I катализирует перенос электронов с НАДН на убихинон через ряд редокс-центров, которые включают в себя флавинмононуклеотид, от 7 до 9 Fe-S-центров и до трех видов полухинонов. Под влиянием двухвалентных катионов этот комплекс может проявлять активные или неактивные свойства (Checchini, 2003).

Сероводород, как и аммиак, принадлежит к группе молекул, проникающих через клеточные мембраны. Таким образом, он способен, по-видимому, взаимодействовать с металлами в составе НАДН-дегидрогеназы, блокируя перенос электронов на комплекс II.

Можно предположить, что H₂ S будет влиять на путь, который связан с окислением сукцината. В этом случае перенос протона от субстрата катализруется ферментом сукцинатдегидрогеназой (Ленинджер, 1985; Лукьянова, 1983; Chechini, 2003). Сукцинатдегидрогеназа прочно связана с внутренней мембраной митохондрий. Одна молекула этого фермента содержит один остаток ковалентно связанного флавинадениндинуклеотида и 2 Fe-S-центра. В одном из этих центров находится 2 атома Fe, а в другом - 4. Все эти атомы железа участвуют в переносе электронов в дыхательную цепь (Ленинджер, 1985). Как видно, сероводород способен, вероятно, “перекрыть” и этот путь электронного транспорта вдоль дыхательной цепи.

Электрон-транспортная цепь митохондрий, по-видимому, доступна для блокирующего действия сероводорода и на следующем участке – комплексе III, который состоит из убихинол-цитохром с оксидоредуктазы или цитохром вс₁ комплекса. Этот комплекс в митохондриях млекопитающих состоит из 11 субъединиц, которые включают мембраносвязанный дигем цитохром в и мембрано-заякоренный цитохром с₁ и [2Fe-2S]-содержащий протеин. H₂S, по-видимому, может взаимодействовать с этими металлами, блокируя перенос электронов с убихинона на цитохром с (Chechini, 2003).

В последнее время большое внимание уделяется меди как металлу, влияющему на клеточное дыхание. Медь является элементом, который играет важную роль в биохимии аэробных организмов. У человека она утилизируется разнообразными, но ограниченными в числе ферментами, чтобы обеспечить возможные электрон-транспортные реакции в ключевых метаболических путях. Дефицит меди приводит к потере активности этих ферментов, снижая в результате окисление железа, образование пигмента, биосинтез нейротрансмиттеров, образование соединительной ткани и клеточное дыхание (Hamza, Gitlin, 2002).

Получены косвенные доказательства, указывающие на то, что медь может быть важной частью в функционировании АТФ-синтазы. Эти данные получены из наблюдений над животными, подвергавшимися действию Cu-диеты, и из экспериментальных данных, полученных на интактных митохондриях и с изменной АТФ-синтазой. Показано, что АТФ-синтаза регулируется естественным белковым ингибитором, который минимизирует бесполезный гидролиз АТФ в деэнергизованных митохондриях (Pedersen, 2000). Этот ингибитор (IF1) найден в стехиометрии 1:1 с энзимом и связывается с одной из бета-субъединиц и ингибирует гидролиз АТФ. Есть некоторые доказательства, что медь способна предотвращать инактивацию АТФ-синтазы посредством IF1 (Mederos, Jennings, 2002). В связи с этими данными напрашивается предположение, что связываясь с медью, сероводород может влиять и на активность АТФ-синтазы.

Таким образом, есть основания считать, что в отличие от аммиака, блокирующего перенос электронов в области комплекса I, сероводород блокирует электронный транспорт на всем протяжении электрон-транспортной цепи. Мишенью его действия, в отличие от аммиака, в начальном участке дыхательной цепи являются комплекс I, в состав которого входят НАДН-дегидрогеназа и ее Fe-S-центры и комплекс II, содержащий сукцинатдегидрогеназу и ее Fe-S-центры.

Можно полагать, что H₂S способен взаимодействовать со всеми белковыми комплексами, содержащими железо, медь и серу, на всем протяжении дыхательной цепи, вплоть до АТФ-синтазы, оказывая на них непосредственное ингибирующее влияние. Столь простой и надежный механизм реагирования обонятельных клеток на гнилостные запахи, может быть, и обеспечивает необычайно высокую чувствительность человека к ним, характеризующуюся ничтожной пороговой концентрацией в воздухе (0,01 - 0,03 мг м^-3).

Известно, что биологическое окисление и фосфорилирование в митохондриях сопряжены между собой. Поэтому ингибирование переноса электронов на всем протяжении электрон-транспортной цепи подавляет синтез АТФ в митохондриях. Прекращается аккумуляция кальция, истощаются его запасы в этих органеллах, что приводит к накоплению его в цитозоле.

Вероятно, с этим связано повышение интенсивности кальциевой флуоресценции в ответ на H₂S и исчезновение реакции на одорант на фоне азида натрия, наблюдаемые в наших опытах.

Следовательно, у одорантов, имеющих острый и гнилостный запахи, общим в механизме действия является то, что как тот, так и другой оказывают непосредственное действие на окислительный метаболизм обонятельных клетках. Однако делают они это по-разному. Аммиак ингибирует клеточное дыхание в начальном участке дыхательной цепи, тогда как H₂S блокирует транспорт электронов на всем ее протяжении (рис. 72 ). Это еще один аспект гетерогенности обонятельной рецепции.