4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток

Одоранты первой группы (амиловый спирт, камфора, цинеол. амилацетат, ванилин) также изменяли в наших опытах собственную флуоресценцию НАДН и ФП. Под действием этих одорантов она усиливалась. Такую реакцию дыхательной цепи можно, вероятно, связать с образованием избытка НАД-зависимых субстратов, обусловленным активацией пахучими веществами синтеза внутриклеточных вторичных посредников, обеспечивающих повышение степени восстановленности пула пиридиннуклеотидов в обонятельной клетке.

Однако возможен и другой механизм, связанный с увеличением содержания кальция в цитозоле, о чем косвенно свидетельствовали результаты исследования флуоресценции комплекса: Са^2+-ХТЦ-КМ. Одной из причин роста интенсивности флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания ионов кальция в цитозоле может быть активация малат-аспартатной челночной системы в митохондриях. Существует прямая корреляция между захватом Са²⁺ митохондриями и интенсивностью собственной флуоресценции НАДН (Лейкин, Виноградов, 1974; Duchen, 2000; Mederos, Jennigs, 2002).

Считают, что индуцируемая кальцием проницаемость митохондриальной мембраны для пиридиннуклеотидов может быть дополнительным путем обмена восстановленных эквивалентов между матриксом митохондрий и цитозолем (Лейкин, 1977). Вероятно, с переносом НАДН в митохондрии можно связать рост интесивности его флуоресценции при увеличении концентрации внутриклеточного Са²⁺, поскольку при этом образуется комплекс Са²⁺-НАДН, имеющий высокий квантовый выход люминесценции (Лейкин, 1977; Преображенский, Денисов, 1977).

Можно предположить проникновение восстановительных компонентов в матрикс митохондрий через РТР- или МРТ-пору (mitochondrial permeability transition). Она образуется в результате деформации комплекса молекул, который собирается в областях контакта наружной и внутренней митохондриальной мембраны. В его состав входит потенциал-зависимый анионный канал (VDAC), располагающийся в наружной мембране митохондрий., где он образует пору диаметром 2,5 – 3,0 нм. Вторым компонентом этого комплекса является транслоказа адениновых нуклеотидов (ANT), локализованная во внутренней митохондриальной мембране. VDAC и ANT могут тесно взаимодействовать друг с другом с образованием комплекса, который способен рекрутировать дополнительные протеины, одним из которых является циклофилин D (СyPD). Он локализуется в матриксе митохондрий (Crompton, 2000).

Эта пора представляет собой высокопроводимый неселективный канал (Rizutto et al., 2000). Через него к транспортной системе митохондрий могу проникать вещества с молекулярной массой до 1500. Активация проницаемости этой поры вызывается ионами кальция, захваченными митохондриями (Hajnoczky et al., 2000; Azarashvili et al., 2002). В результате этого каналы обеспечивают генерализованную проницаемость внутренней мембраны митохондрий, индуцируемую ионами кальция. Открывание РТР характеризуется большим числом субпроводимости (O`Rouke, 2000).

Показано, что при повышении пула восстановленных пиридиннуклеотидов в матриксе митохондрий резко увеличивается потребление кислорода, то есть активируется клеточное дыхание (Mederos, Jennigs, 2002).

Как выявили результаты наших исследований, стимуляция обонятельной выстилки амилацетатом, амиловым спиртом, камфорой, цинеолом и ванилином инициирует вход кальция в цитозоль, а при повышении его внутриклеточного содержания он быстро аккумулируется митохондриями (Гайнутдинов, 1972: Rassmussen, Barret, 1988; Rizzuto et al., 1993; White, Reinolds, 1997; Pozzan, Rizzuto, 2000). Для этого необходима близость или даже контакт между митохондриями и источником локального повышения кальция (Rizzuto, 1993; Pozzan, Rizzuto, 2000).

Однако из данных ультраструктурных исследований обонятельных клеток видно, что эти органоиды не содержатся в обонятельных жгутиках, а сосредоточены в области булавы и проксимальных отделов периферического отростка (Бранштейн, 1966). Вероятно, ионы кальция, вошедшие в обонятельный жгутик под действием одоранта, могут распространяться к месту скопления митохондрий, образуя здесь локальные зоны концентрированного содержания Са²⁺. Скорость распространения кальция в кортикальных астроцитах крысы около 25 мкм в с (Duchen, 2000). Такие сложные пространственно-временные паттерны изменений концентрации внутриклеточного кальция, вызванные стимуляцией рецептора, обнаружены во многих типах клеток (Rassmussen, Gustin, 1978; Alkon, Rassmussen, 1988; Berridge et al., 1988; Rizzuto et al., 1993; Berridge, 1997; Sham, 1997).

Захват Са²⁺ митохондриями управляется митохондриальным мембранным потенциалом и зависит от наличия Са²⁺-унипортера, активность которого увеличивается в кубической зависимости при увеличении содержания свободного цитозольного кальция (Chen, 1988; Khana et al., 1988; Hajnoczky et al., 2000; Pozzan, Rizzuto, 2000). Функция унипорта заключается в том, чтобы транспортировать Са²⁺ по его электрохимическому градиенту в матрикс митохондрий во время повышения его содержания в цитоплазме. Полагают, что он представляет собой канал, регулируемый двухвалентными катионами и нуклеотидами и блокируется рутениевым красным (O’Rouke, 2000).

Можно предположить, что взаимодействие пахучих веществ с мембранными рецепторами обонятельных жгутиков, активируя систему вторичных посредников, изменяет проницаемость плазмолеммы для кальция, который, в свою очередь, инициирует малат-аспартатную систему, что приводит к повышению митохондриального пула НАДН и усилению клеточного дыхания. Следовательно, увеличение флуоресценции НАДН под влиянием амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина свидетельствует об активации митохондриального дыхания обонятельных клеток.

Одной из причин усиления флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания ионов кальция в цитозоле может быть активация кальцием митохондриальных ферментов. Показана прямая корреляция между концентрацией митохондриального кальция и увеличением уровней НАДН, продукцией митохондриального АТФ и активацией энзимов в этих органеллах (Duchen, 2000; Rizzuto et al., 2000; Pozzan, Rizzuto, 2003;). Основными мишенями пути импорта кальция в митохондрии являются дегидрогеназы цикла трикарбоновых кислот, которые им активируются, и, в частности, сукцинатдегидрогеназа (Duchen, 2000).

Войдя в цитозоль из интерстиция, Са²⁺ усиливает окисление сукцината и повышает интенсивность митохондриального дыхания, что сопровождается возрастанием уровня НАДН (Лейкин, Виноградов, 1974; Akerman, 1981). Считают, что в живой клетке, где агонист-зависимое повышение цитозольного Са²⁺ происходит параллельно повышению уровней восстановленных НАДН, нарастание содержания этого иона в митохондриях может увеличить доступ восстанавливающих эквивалентов к дыхательной цепи (Pralong et al., 1994; Rizzuto et al., 1994; 2000). При этом увеличение НАДН, сопряженное с повышением внутриклеточного Са²⁺, в стимулируемых клетках, в свою очередь активировало синтез АТФ в митохондриях и, следовательно, увеличение его содержания в цитозоле. Это обусловливалось увеличением активности митохондриальной АТФ-синтазы, зависимой от концентрации матричного кальция (Jouaville et al., 1999).

Показано, что модуляция продукции АТФ в клетках появляется с определенной функционально значимой микрогетерогенностью. Так, микродомены АТФ могут существовать вблизи Са²⁺-насосов эндоплазматического ретикулума или концентрироваться в субплазматическом пространстве и в митохондриях, а не во всей цитоплазме (Landolfi et al., 1998; Kennedy et al., 1999). Этот путь стимуляции окислительного метаболизма в обонятельных клетках кажется более вероятным. Причина усиления интенсивности флуоресценции НАДН и ФП при увеличении содержания кальция внутри клетки, которые мы регистрировали в ответ на стимуляцию одорантами первой гуппы, может заключаться в активации кальцием сукцинатдегидрогеназы и переходе на окисление сукцината.

Вероятно, активирующее действие пахучих веществ можно объяснить наличием ротенонрезистентного пути восстановления НАД в обонятельных клетках. Показано, что на фоне ротенона может происходить увеличение дыхательного контроля сукцината за счет того, что в присутствии последнего происходит практически полное восстановление дыхания, подавленного ингибитором, до тех значений, до которых он его стимулировал без ротенона или даже выше (Лукьянова и др., 1982). С этим, по-видимому, связано учащение двигательной активности жгутиков при стимуляции амилацетатом (Бронштейн, 1977).

В пользу данного предположения свидетельствует и то, что в области булавы периферического отростка обонятельных клеток земноводных отмечается высокая активность сукцинатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, а также значительное содержание белков, богатых карбоксильными и сульфгидрильными группами (Бронштейн, 1977).

Эти энзимы остаются активированными даже при снижении уровня цитозольного кальция (Rassmussen, Barret, 1988), что связано, очевидно, с темпами обмена кальция между цитозолем и митохондриями. Концентрация этого иона в митохондриальном матриксе остается повышенной в течение десятков секунд после того, как его уровень в цитоплазме вернется в исходное состояние (Hajnoczky et al., 1995; White, Reinolds, 1997; Drummond et al., 2000; Duchen, 2000; Hainoczky et al., 2000; Rizzuto ey al., 2000;). Видимо, поэтому при стимуляции обонятельных клеток амиловым спиртом, амилацетатом, камфорой, ванилином и цинеолом продолжительность реакции усиления собственной флуоресценции НАДН и ФП была гораздо дольше времени усиления флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ, то есть процесс активации митохондриального дыхания длился дольше, чем динамика мембраносвязанного кальция.

Повышение активности сукцинатдегидрогеназной системы митохондрий является весьма чувствительной характеристикой состояния клеточного дыхания при изменении физиологического сосотояния организма в условиях воздействия факторов среды (Васин, Королева, 2001). Усиление окисления сукцината является основой компенсаторных восстановительных процессов при нормальных физиологических условиях. При переходе ткани в активное состояние, когда необходимо усиление продукции энергии, в системе окисления происходит перестройка на преимущественное образование и использование сукцината. Переход на сукцинат позволяет повысить мощность системы окислительного фосфорилирования, то есть скорость выработки АТФ (Кондрашова, 1970; 1971; 1972). Это связано со стимуляцией митохондриального дыхания активированными дегидрогеназами, увеличивающей мебранный потенциал митохондрий и управляющей увеличением продукции АТФ (Duchen, 2000).

Таким образом, одоранты с камфорным, эвкалиптовым, прогорклым, цветочным и фруктовым запахами активируют клеточное дыхание, причем его стимуляция сопряжена с повышением содержания ионов кальция в цитозоле (Drummond et al., 2000). В обонятельных клетках увеличение содержания Са²⁺обусловлено его входом из внеклеточной среды, инициируемым одорантами. По-видимому, с транспортом этого иона связаны как генерация рецепторного потенциала на мембране жгутиков, так и стимуляция дыхательной цепи митохондрий рецепторных клеток.

Чтобы ответить на вопрос, оказывают ли эти одоранты свое влияние на митохондриальное дыхание непосредственно или через систему вторичных посредников, мы проводили эксперименты с использованием ингибиторов аденилатциклазы – 2,5-дидеоксиаденозина и фосфолипазы С – неомицина. При ингибировании основных ферментов сигнальных путей стимуляция амиловым спиртом, камфорой, цинеолом, амилацетатом и ванилином в одной части опытов вызывала резкое ослабление динамики окислительно-восстановительных процессов в митохондриях, а в другой части опытов изменений окислительного метаболизма не наблюдалось.

Сохранение реакции митохондрий на одоранты, когда ферменты, синтезирующие вторичные посредники, не функционируют, можно, вероятно, связать с активностью G-белка, поскольку ингибировались эффекторные молекулы, которые в цепи передачи сигнала локализуются после него. Предположение основано на том, что обдувание обонятельной выстилки камфорой и цинеолом не инициировало изменений окислительного метаболизма на фоне ингибиторов соответственно фосфолипазы С и аденилатциклазы. Но, как следует из наших данных, механизм трансдукции именно этих одорантов не вовлекает в обонятельную рецепцию G-белок.

Основную роль во взаимодействии ГТФ-связывающих белков с белками-мишенями приписывали альфа-субъединице G-протеинов. Однако в последнее время обнаруживаются новые функциональные свойства у бета-гамма-димера G-протеина. Он активирует К⁺-селективный ионный канал в клетках предсердий, взаимодействует и активирует некоторые эффекторы, включая ФЛС-бета2 и бета3, аденилатциклазу, Са²⁺-каналы. Таким образом, G-бета-гамма димер обладает своей специфической сигнализацией, причем он способен обеспечить большое разнообразие физико-химических процессов в клетке, так как обнаружено 5 различных бета- и 12 гамма-субъединиц G-белка. И если бета-гамма-димер образуется случайным образом, то возможно 60 комбинаций, причем каждое сочетание этих субъединиц будет проявлять клеточную или тканевую специфичность.

Гетерогенность, которая проявляется в свойствах этих субъединиц, обусловливается тем, что каждый эффектор контактирует с уникальной последовательностью аминокислотных остатков в активном центре молекул субъединиц G-белка. Сигнальная специфичность бета-гамма-димера G-протеина объясняется такими факторами, как дискретная субклеточная локализация эффекторов, компартментализация компонентов сигнальной трансдукции, а также экспресси сигнальных молекул, специфических для данного типа клеток (Cabrera-Vera et al., 2003). Вероятно, сохранение изменения окислительного метаболизма в обонятельных клетках в ответ на стимуляцию амиловым спиртом, амилацетатом и ванилином обусловливается способностью G-бета-гамма димера независимо взаимодействовать с эффекторными молекулами.

Возможен и другой путь. Так, например, в клетках обнаружены LIM-киназы. Их каталитическая активность направлена на Ser/Tre-остатки. Доказано, что эти киназы опосредуют внутри- и межмолекулярные протеин-протеиновые взаимодействия. Считают, что они играют специфическую роль в неизвестных сигнальных путях. У человека LIM-киназа 1 взаимодействует с ПКС-гамма и ПКС-кси, а домен LIM2 связывает LIM-киназу 1 с ПКС-гамма. ПКС-кси и ПКС-дельта являются атипичными протеинкиназами, не зависящими от кальция и диацилглицерола (Schenk, Snaar-Jagalska, 1999). Поскольку локализация компонентов сигнальных путей строго компартментализована, и они выполняют свои специфические функции в определенных участках клеток, то можно предположить, что какие-то новые пути включаются в реакцию, когда основные ферменты механизма трансдукции выключены.

Все эти косвенные факты подкрепляют предположение о том, что свое активирующее влияние на митохондрии амиловый спирт, амилацетат, камфора, ванилин и цинеол осуществляют опосредованно – через соотвествующие сигнальные системы и кальций. Причем вход кальция в клетку под действием амилового спирта, амилацетата и цинеола обеспечивается активностью аденилатциклазы, а при обонянии камфоры и ванилина – фофсфолипазы С (рис. 73).

Таким образом, рецепция одорантов, обладающих камфорным, фруктовым, цветочным, прогорклым и эвкалиптовым запахами, обеспечивается внутриклеточными сигнальными системами, что связано с изменением клеточного метаболизма, и активацией клеточного дыхания. В обоняние острых и гнилостных запахов не вовлекаются внутриклеточные сигнальные системы. Вероятно, сигнальным признаком для них является прямое ингибирование клеточного дыхания, но механизм ингибирования у острых и гнилостных запахов различен.

В принципиальных различиях действия на окислительно-восстановительное состояние дыхательной цепи митохондрий качественно разных одорантов, принадлежащих как одной группе (представлены на рис. 73) так и, в еще большей степени, двум группам, подтверждается гипотеза гетерогенности обонятельной рецепции.

Неоднородность механизмов хемотрансдукции была обнаружена во вкусовых, каротидных и медуллярных рецепторах. Так, сопоставление реакций метаболических систем клеток вкусовой луковицы на химические вещества с разным вкусом показало различие в окислительно-метаболических процессах, происходящих при восприятии горечей и кислот, с одной стороы, и сладких и соленых агентов, с другой. Метаболические системы вкусовых клеток непосредственно участвуют в кодировании информации только о горечах и кислотах. В рецепции веществ со сладким и соленым вкусами они осуществляют, вероятно, только энергетическое обеспечение кодирования, причем энерготраты вкусовых рецепторов в этих процессах невелики (Соловьев, Самойлов, 1977; 1978; Самойлов, 1983).

Подытоживая результаты исследования флуоресценции обонятельных клеток, можно заключить, что восприятие запахов разного качества обеспечивают неоднородные физико-химические процессы. Следовательно, не только вкусовой, каротидной, медуллярной, но и обонятельной рецепции присуща гетерогенность биофизических механизмов трансдукции.