- •Глава 1. Обзор литературы (клеточно-молекулярные основы обонятельной трансдукции)
- •Строение органа обоняния
- •1.2. Строение обонятельных клеток
- •Механизмы обонятельной трансдукции
- •Участие обонятельных рецепторных комплексов в рецепции одорантов
- •1.3.2. Роль внутриклеточной сигнальной системы цАмф в рецепции одорантов
- •1.3.2.1. Роль аденилатциклазы в обонятельной рецепции
- •1.3.3. Участие Golf-белка в рецепции одорантов
- •1.3.5. Участие фосфоинозитидного пути передачи сигнала в обонятельных клетках
- •1.3.5.1. Роль фосфолипазы с в обонятельной трансдукции
- •1.3.5.2. Участие протеинкиназы с в обонятельной трансдукции
- •Роль тирозинкиназной сигнальной системы в обонятельной рецепции
- •1.4. Двигательная активность обонятельных жгутиков
- •1.5. Влияние одорантов на митохондриальное дыхание обонятельных клеток
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1. Объект исследования
- •2.2. Методы люминесцентной микроскопии
- •2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках
- •2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток
- •2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия
- •2.3. Метод прижизненной телевизионной микроскопии
- •2.4. Электроольфактография
- •2.5. Методика стимуляции обонятельной выстилки
- •2.6. Фармакологический анализ
- •Глава 3. Результаты исследований
- •3.1. Исследование компонентов внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции различных одорантов
- •3.1.1. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции амилового спирта
- •3.1.2. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции камфоры
- •3.1.3. Исследование компонентов сигнальных систем, участвующих в рецепции цинеола
- •3.1.4. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилацетата
- •3.1.5. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции ванилина
- •3.1.6. Исследование компонентов сигнальных систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции аммиака
- •3.1.7. Исследование участия внутриклеточных сигнальных систем обонятельных клеток в рецепции сероводорода
- •3.2. Исследование влияния одорантов на митохондриальное дыханине обонятельных клеток
- •3.2.1. Исследование влияния амилового спирта на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.2. Исследование влияния камфоры на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.3. Исследование влияния цинеола на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.4. Исследование влияния амилацетата на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.5. Исследование влияния ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.6. Исследование влияния аммиака на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.2.7. Исследование влияния сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •3.3. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •3.3.1. Энергетическое обеспечение двигательной активности обонятельных жгутиков
- •3.3.2. Роль цитоскелета в движениях обонятельных жгутиков
- •Глава 4. Обсуждение результатов
- •4.1. Исследование внутриклеточных сигнальнх систем обонятельных клеток, участвующих в рецепции амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина
- •4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
- •4.3. Исследование влияния аммиака и сероводорода на активность дыхательной цепи митохондрий
- •4.4. Исследование влияния амилового спирта, камфоры, цинеола, амилацетата и ванилина на активность дыхательной цепи митохондрий обонятельных клеток
- •4.5. Исследование влияния одорантов на двигательную активность обонятельных жгутиков
- •Заключение
- •Список литературы
4.2. Исследование механизмов обонятельной трансдукции аммиака и сероводорода
Во вторую группу одорантов входили аммиак, обладающий острым запахом, и сероводород – гнилостным. Обдувание ими обонятельного эпителия приводило к усилению флуоресценции комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ, что связано, очевидно, с повышением кальций-аккумулирующей способности мембран обонятельных клеток.
При стимуляции аммиаком и сероводородом на фоне 2 мМ раствора ЭГТА рецепторные клетки не теряли способности реагировать на раздражитель. Сохранение реакции при отсутствии внеклеточного кальция свидетельствует о том, что повышение флуоресценции связано с поступлением кальция из внутриклеточных депо. Следовательно, в ответ на действие аммиака и сероводорода кальций входит в цитозоль обонятельных клеток не из окружающей среды, а из внутриклеточных депо. Ими могли быть митохондрий или эндоплазматический ретикулум.
Общепринятым приемом в исследовании участия эндоплазматического ретикулума в реакциях на стимулы является регистрация ответов на действие тапсигаргина. Ингибируя Са2+-АТФазу в мембране эндоплазматического ретикулума, он создает условия для выхода Са2+ в цитозоль (Авдонин, Ткачук, 1994; Крутецкая и др., 2003). Проведенные исследования показали, что на стимуляцию тапсигаргином не регистрировались реакции, подобные действию аммиака. Следовательно, есть основания считать, что усиление свечения комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ при обдувании обонятельного эпителия аммиаком не обусловливается выходом Са2+ из эндоплазматического ретикулума.
В таком случае источником Са2+, обеспечивающего реакцию обонятельных клеток на аммиак, могут быть митохондрии. Их участие в этой реакции следовало доказать не только методом исключения. Важно было выяснить, будет ли изменяться флуоресценция комплекса: Са2+-ХТЦ-КМ при ингибировании митохондрий. С этой целью обонятельную выстилку обрабатывали в ротеноне или FCCP. Изменение интенсивности флуоресценции, индуцируемой аммиаком в обонятельных клетках, резко ослабевало, вплоть до отсутствия ответов, после ингибирования митохондриального дыхания ротеноном или FCCP. Это свидетельствует об участии в реакциях на аммиак митохондрий обонятельных клеток.
Косвенным подтверждением нашего вывода служат результаты опытов с действием аммиака in vitro на митохондрии, выделенные из переднего мозга крыс (Косенко и др., 2001).
В реакцию на H2S также вовлекаются ионы кальция из внутриклеточных депо. В качестве митохондриального ингибитора мы применяли азид натрия – ингибитор терминального участка дыхательной цепи митохондрий. На фоне азида натрия реакция на сероводород исчезала. Следовательно, усиление флуоресценции комплекса Са2+-ХТЦ-КМ под влиянием H2S обусловливается, вероятно, прямым влиянием одоранта на митохондрии.
Таким образом, в отличие от одорантов первой группы, в обонятельную рецепцию аммиака и сероводорода не вовлекаются сигнальные системы. Эти одоранты действуют непосредственно на митохондрии, что служит еще одним аргументом в пользу концепции гетерогенности обонятельной рецепции.