2.2. Протокол обследования больного волосатоклеточным лейкозом.

Предложен протокол обследования первичного больного с диагнозом волосатоклеточного лейкоза (Приложение, схема 1), включающий в себя: опрос больного и физикальный осмотр; рутинные лабораторные исследования, ЭКГ, рентгенография грудной клетки, УЗИ брюшной полости; специальные лабораторные исследования – миелограмма, трепанобиопсия cгистологическим и иммуногистохимическим исследованием костного мозга, иммунохимическое исследование сыворотки крови и мочи, цитохимическое исследование лимфоцитов лейкоконцентрата и/или костного мозга на тартрат-устойчивую кислую фосфатазу, иммунофенотипирование лимфоцитов крови и/или костного мозга, кариологическое исследование костного мозга.

Для больных из других лечебных учреждений были проведены дополнительные исследования и обработаны имеющиеся данные.

Методики исследований.

I. Рутинные исследования.

1. Цитологическое исследованиемазков периферической крови и костного мозга проводилось в клинико-диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (зав. лабораторией – к.м.н. Л.Ю.Тихонова). Использовались стандартные методы фиксации и окраски.

2. Гистологическое исследованиекостного мозга (трепанобиопсия) проводилось в патологоанатомическом отделении ГНЦ РАМН (руководитель – член-корр. РАМН, проф. Г.А.Франк). Гистологическое исследование выполнялось на срезах толщиной 3-5 мкм, окрашенных гематоксилин-эозином. Иммуногистохимическое исследование (в.н.с., к.м.н. И.Б.Капланская) выполняли на срезах толщиной 3-5 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытыеL-полилизином. Использовался авидин-биотин-пероксидазный метод с панелью моноклональных и поликлональных антител к:CD21,CD21,CD45RO,CD43,CD3,CD79a,CD5,CyclinD1,bcl-2,Ki-67,CD25,DBA.44.

II. Специальные исследования.

1. Иммунофенотипированиелимфоцитов проводили в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией – профессор, д.м.н. Т.И.Булычева, в.н.с. лаборатории к.б.н. Р.С.Самойлова). Во всех включенных в анализ случаях определялись общие В-клеточные маркерыCD19,CD20,CD22, клональность В-лимфоцитов по легким цепямIgкаппа (k) и лямбда (λ), специфические для ВКЛ антигеныCD103, анти-ВКЛ,CD85, НС2, активационные антигеныCD11c,CD25,CD38 и прочие дифференциально-диагностические антигены -FMC7,CD10,CD23,CD5. Лимфоциты крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фекола. Выделенные лимфоидные клетки трижды отмывались холодным 0,9% растворомNaClс 0,01М фосфатным буферомpH7,2-7,4 (PBS).

Методика непрямого иммунофлюорисцентного маркирования мембранных антигенов: концентрацию опухолевых клеток в суспензии доводили до 4-5 млн./мл. По 100 мкл суспензии опухолевых клеток в данной концентрации вносили в 96-луночные круглодонные плашки. Клетки осаждали путем центрифугирования 300g– 5 мин. После удаления надосадочной жидкости, согласно выбранной панели антител, в каждую лунку вносили по 20 мкл немеченых мышиных моноклональных антител в заранее отработанном рабочем разведении вPBSс 1% добавкой бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокирования неспецифического связывания антител. В контрольные лунки вместо вместо моноклональных антител вносили 20 мкл среды : 0,01МPBSpH7,4 – 100мл, БСА – 1г (1%), прогретая эмбриональная телячья сыворотка – 2% (v/v),NaN₃до 0,1%. Инкубировали 30 мин приt+4^о. Далее, после 2-кратной отмывки холоднымPBS, наносилиF(ab)₂-фрагменты поликлональных козьих антител против мышиных иммуноглобулинов, коньюгированных с флюоресцин-изотиоцианатом (FITC), в в подобранном рабочем разведении. Инкубировали 30 мин приt+4^ос последующей 3-кратной отмывкой. 8-луночные предметные стекла (Flow, Великобритания) покрывали 15-20мкл раствораL-полилизина 25 мкг/мл на физ. растворе (Sigma, США), для чего их инкубировали во влажной камере в течение 30 мин., перед нанесением клеточной суспензии стекла промывалиPBS. После последней отмывки клетки ресуспендировали в 50 мклPBS, 25 мкл полученной суспензии наносили на предметные стекла. Клетки осаждались на стекле в результате 30-минутной инкубации во влажной камере. Излишки раствора удаляли, клетки заключали в забуференный фосфатным буфером 1:1 глицерин, предметное стекло герметично закрывали покровным. Результаты анализировали путем флюоресцентной и фазово-контрастной микроскопии (микроскоп «Axiophot» фирмы «Opton», Германия). Кроме количественного определения числа позитивных клеток (%) оценивалась степень экспрессии антигенов по интенсивности флюоресценции. Интенсивность свечения нормальных В-лимфоцитов из крови донора принималась за умеренную (+). Соответственно этой точке отсчета отмечалось отсутствие свечения (-), слабое (±) или сильное свечение (++). Использовавшиеся моноклональные антитела приведены в таб.1.

Таблица 1. Панель использованных при иммунофенотипировании моноклональных антител.

Кластер дифферен- цировки	Cпецифичность
CD3	Т-клетки, входит в состав Т-антигенного рецептора
CD4	Т-хелперы/индукторы
CD5	Зрелые Т-клетки, часть В-лимфоцитов, лиганд CD72
CD8	Т-супрессии/киллеры
CD10	Пре-В, В-лимфоциты центра фолликула, гранулоциты, мембранная эндопептидаза
CD19	Предшественники и зрелые В-лимфоциты
CD20	Часть предшественников и зрелые В-лимфоциты
CD21	Предшественники и зрелые В-лимфоциты, CR2 рецептор комплемента иEBV
CD22	Предшественники (сначала в цитоплазме) и зрелые В-лимфоциты, медиатор адгезии к другим клеткам
CD23	Часть В-лимфоцитов, моноциты, эозинофилы, дендритные клетки
CD25	Активированные В- и Т-лимфоциты, α-рецептор ИЛ-2
CD35	Гранулоциты, моноциты, В-лимфоциты, эритроциты, CR1 рецептор комплемента
CD38	Плазмациты, тимоциты, активированные Т- и В-лимфоциты
CD43	Зрелые Т-лимфоциты, часть В-лимфоцитов
CD71	Рецептор трансферрина
-	FMC7 – конформационный эпитоп антигенаCD20, иммунологически зрелые В-лимфоциты
-	Anti-kappa/lambda– моноклональные антитела к легким цепямIg
-	Ki-67 – ядерный антиген делящихся клеток фазыG1-М
CD11c	«ворсинчатые» В-лимфоциты
CD103	Активированные CD8^+Т-лимфоциты, «ворсинчатые» В-лимфоциты
Анти-ВКЛ (DBA.44)	В-лимфоциты, моноциты, «ворсинчатые» В-лимфоциты
CD85	Иммуноглобулин-подобный рецептор Т-лимфоцитов, NK-клеток

2. Тартрат-устойчивую кислую фосфатазу (TRAP)лимфоцитов определяли в лаборатории гемоцитологии (заведующий – профессор, д.м.н. Г.И.Козинец, в.н.с. лаборатории к.б.н. О.А.Дягилева, с.н.с. к.б.н. И.Н.Наумова) на фиксированных мазках лейкоконцентрата или костного мозга, инкубированных в смеси реактивов в течение 2 часов при 37^о.

3. Иммунохимическое исследование белков крови и мочипроводили в лаборатории гуморального иммунитета ГНЦ РАМН (зав. лабораторией к.м.н. Е.Ю.Варламова). Содержание в сывороткеIgA,IgG,IgM, легких цепей каппа и лямбда определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле агарозы. Для выявления секреции моноклонального иммуноглобулина исследовали образцы сыворотки и концентрированной мочи методом электрофореза в геле агарозы и иммунофиксации. Уровень ЦИК определяли методом осаждения в ПЭГ-6000.

По результатам проведенного обследования из 160 включенных больных были сформированы следующие группы:

1. По форме заболевания –

а) с типичной формой ВКЛ - 118 пациентов;

б) с вариантной формой ВКЛ (без лейкопении) - 42 пациента.

2. По возрасту–

больные ВКЛ молодого возраста (≤40 лет) - 41 пациент;

В каждой из выделенных групп больных оценивали клинические особенности течения заболевания, данные лабораторных исследований, эпидемиологические данные по полу и возрасту, по частоте выявления типичного и абберантного иммунофенотипа.

Проведен сравнительный анализ эффективности различных вариантов хирургического (спленэктомия) и консервативного (α-Иф, кладрибин) лечения во всех группах. Охарактеризован спектр и тяжесть осложнений проводимого лечения. Проанализированы редкие случаи заболевания: ВКЛ с секрецией парапротеина, с выраженной лимфаденопатией, с хроническим лимфолейкозом, с Т-клеточной клональностью. Приведены данные о встречаемости вторых опухолей у включенных в исследование больных ВКЛ. Проведен анализ рецидивов заболевания за 12-летний период и результаты их лечения.

0. Протокол лечения больных ВКЛ

Предложен протокол лечения (Приложение, схема 2), в соответствии с которым предполагается терапия α-Иф в течение 3-4 мес с последующим недельным курсом химиотерапии кладрибином, после чего пациента наблюдают без лечения.

Показаниями к началу терапии считали:

- выраженную или нарастающую цитопению (гематокрит < 25%, тромбоциты < 50х10⁹/л, нейтрофилы < 0,5х10⁹/л);

- симптомную или массивную спленомегалию (> 20х6см);

- присоединение инфекционных осложнений.

При наличии тяжелой симптомной тромбоцитопении выполняли спленэктомию с последующим наблюдением и, при отсутствии ремиссии, лечением последовательно α-Иф и кладрибином.

0. Статистический анализ.

Статистическую обработку данных проводили совместно с отделом компьютеризации ГНЦ РАМН (зав. отд. Б.В.Зингерман) методами описательной статистики и анализа выживаемости. В работе использовались кривые выживания типа «общая выживаемость»: время от начала лечения до смерти или последнего сообщения о больном (цензурирование), и «безрецидивная выживаемость»: время от начала ремиссии до наступления рецидива или последнего сообщения о больном (цензурирование). Использован метод построения кривых Каплан-Маера. Достоверность рассчитывали по тестам Wilcoxon-Gehan,Mantel-Haenszel(обобщенный Хи-квадрат),Logrank, показатели считали достоверными приp<0.05 для всех трех критериев.