immunologia_N3-4_2010_block_210x297

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

УДК: 613.26-056.3:613.34

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ IGE АНТИТЕЛ К СОЕ В ДИАГНОСТИКЕ ПИЩЕВОЙ АЛЛЕРГИИ.

ПРИЛУЦКИЙ А.С., ФИЛАТОВА Л.А., ЛЕСНИЧЕНКО Д.А.

Донецкий национальный медицинский университет им.М.Горького Кафедра клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии (зав. кафедрой проф. Прилуцкий А.С.)

АКТУАЛЬНОСТЬ

Последние десятилетия отличаются бурным ростом частоты аллергических заболеваний во всем мире, в том числе обусловленных особенностями питания. Поэтому все больше внимания врачи и широкая общественность стали уделять пищевой аллергии. Причины резкого нарастания аллергических болезней связывают с серьезными изменениями экологии и др. Точные статистические данные о заболеваемости и летальности при пищевой аллергии отсутствуют, что можно объяснить трудностями объективной диагностики и установления аллергической природы заболевания, а также большими расхождениями в трактовке клинических реакций на прием пищевых продуктов. Проведение эффективных лечебно-профилактических мероприятий у пациентов с аллергическими заболеваниями должно осуществляться с учетом достоверной информации о том, на какие конкретно аллергены имеет место сенсибилизация у больного [1]. В связи с этим особую актуальность приобретает достоверная специфическая диагностика аллергии с определением причинных аллергенов в каждом конктретном случае. Поэтому, важной научно-практической задачей является разработка методов, позволяющих быстро и достоверно выявлять наличие у пациента сенсибилизации к определенному пищевому аллергену.

Несмотря на то, что все пищевые белки потенциально могут быть причиной развития аллергических реакций, выделяют 8 самых значимых по частоте аллергенов: молоко, яйцо, рыба, ракообразные, пшеница, арахис, грецкий орех, соя [2]. Независимо от того, что пороговая доза соевого белка, необходимая для развития аллергической реакции, более чем в 100 раз превышает пороговые дозы других значимых пищевых аллергенов [3], имеет место достаточно большая распространенность сенсибилизации к данному продукту среди населения, что связано с широким использованием сои в пищевой промышленности (табл.1).

Согласно немногочисленным данным за последние годы, случаи аллергии к сое, в том числе у детей раннего возраста - причина возникновения тяжелых клинических форм аллергии. Следует отметить, что в основе непереносимости могут лежать иммуноаллергические механизмы, которые могут реализовываться специфическими IgE и IgG антителами.

Следует указать, что международными консесусами определено, что диагностика должна базироваться на определении специфических IgE антител [4,5]. Нерешенной проблемой в настоящее время является отсутствие или дороговизна качественных диагностических систем для диагностики аллергии к пищевым продуктам и, в частности, к сое.

Таблица 1

Соевые продукты, используемые в пищевой промышленности

Изделия из сои	Ингредиенты, содержащие сою	Продукты, содержащие сою
Соевая мука	Соевый белок	Колбасы
Соевые орехи	Структурный растительный белок	Мисо
Соевое молоко	Гидролизированный растительный белок	Соевый соус
Ростки фасоли	Гидролизированный соевый белок	Вустерширский соус
Соевые зерна	Гидролизированный овощной белок	Тамари (вид соевого соуса)
Соевый творог	Натуральное и искусственное	Темпе (лепешка из соевых бобов)
Тофу и др.	ароматизирующее вещество (может быть	Овощной бульон
	изготовлено на основе сои)	Некоторые виды злаков
	Овощной крахмал и др.	Некоторые смеси для кормления
		Выпечка и др.

91

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка возможности использования разработанной ООО «Укрмед Дон» иммуноферментной тест-системы для определения иммуноглобулинов Е к сое в сыворотке крови.

При разработке иммуноферментной тестсистемы ставились следующие задачи: диагностика клинически значимого количественного содержания специфического IgE, а не только выявление положительной сенсибилизации; возможность постоянного контроля эффективности противоаллергических мер, а также ранней диагностики возможных осложнений и/ или рецидивов заболевания; используя малые объемы крови, необходимой для анализа (до 2-3 мл при выполнении 20-30 анализов); высокая специфичность и чувствительность анализа; простота и быстрая выполнимость методики (3-4 часа); безопасность для обследуемого.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованы сыворотки крови 39 пациентов с непереносимостью продуктов, в состав которых входит соевый белок в возрасте от 4 месяцев до 59 лет. В качестве контрольной группы

обследованы 34 лиц аналогичного возраста без наличия аллергии. Все обследованные проходили анкетирование, с помощью которого выяснялись жалобы и анамнез, в том числе аллергологический. Для детей нормы специфического IgE были подобраны исходя из средних уровней общего IgE у несенсибилизированных лиц соответственного возраста.

Определение уровня антител класса Е к сое

всыворотке крови обследованных проводилось с помощью разработанной первой отечественной тест-системы «СОЯ – IgЕ» ООО «Укрмед Дон», город Донецк. Характеристика иммуноферментной тест-системы представлена

втаблице 2. В набор включена калибровочная кривая, позволяющая определять содержание специфического IgE в МЕ/мл. Концентрация исследуемого показателя на уровне <0,35 МЕ/мл характеризуется как недетектируемая, 0,35-0,7 МЕ/мл – низкая, 0,7-3,5 МЕ/мл – средняя, 3,5- 17,5 МЕ/мл – высокая, 17,5-50,0 МЕ/мл – очень высокая, 50,0-100,0 МЕ/мл – интенсивно высокая, >100,0 МЕ/мл – крайне высокая. Для учета оптической плотности использовался разработанный иммуноферментный анализатор СК-01.

Таблица 2

Характеристика иммуноферментной тест-системы для определения содержания специфического IgE к сое производства ООО «Укрмед Дон»

Параметры	Характеристика
Принцип метода	Твердофазный, ИФА
Общее время анализа	3 ч 30 мин
Диапазон измерений, МЕ/мл	0-100
Оптическая плотность диапазона	0,04-6,00
Чувствительность, МЕ/мл	0,1
Коэффициент вариации	не >5%
Объем сывороки для исследования в дублях	100 мкл

При разработке системы в качестве объекта сравнения использованы сыворотки 12 пациентов, обследованных хемилюминесцентным методом.

Проводимая при помощи программы «MedStat» статистическая обработка полученного материала включала анализ распределения. Использовались непараметрические критерии сравнения (Уилкоксона), расчитывался критерий -квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что разработанная тестсистема характеризуется линейностью калибровочной кривой (рис.1), высокой чувствительностью (0,1 МЕ/мл) и широким диапазоном оптической плотности кривой и исследуемых образцов (оптическая плотность стандарта 100 МЕ/мл достигает 6,000 ед. и выше), что обуславливает продлевание срока ее эксплуатации до 4-5 лет с сохранением экстинции верхней точки не ниже 2 ед.

92

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

Рис.1. Внешний вид калибровочной кривой для определения специфического IgE с помощью разработанной тест-системы.

При обследовании установлено, что удельвил 2,9+2,9% среди здоровых лиц и 53,8+8,0%

ный вес лиц, имеющих уровни исследуемых ан-							среди пациентов с аллергией на указанный про-
тител, превышающие возрастную норму, соста-							дукт (рис.2).
100%
80%
60%
											нормальный уровень
40%											повышенный уровень
20%

0%

здоровые

пациенты

Рис.2. Удельный вес лиц с повышенным уровнем специфического IgE к сое среди здоровых лиц и пациентов с подозрением на аллергию к соевому белку (%).

При обследовании установлено совпадение результатов, полученных на импортной и отечественной системе. При этом, следует отметить более высокую чувствительность отечественной иммуноферментной тест-системы, о чем свидетельствует более высокое (в 3-4 раза) число имупульсов, регистрируемое в случае повышенного содержания специфического IgE.

Следует подчеркнуть, что разработанная тест-система позволяет определять уровень специфических IgE антител практически к любому комплексу имеющихся аллергенов, включая ряд продуктов, более характерных для упо-

требления в Украине (творог, кефир, ряженка, копченое сало и др.).

Таким образом, разработана первая отечественная тест-система для определения уровня иммуноглобулинов класса Е к сое в сыворотке крови. Определен удельный вес лиц с диагностическими уровнями антител класса IgЕ к указанному продукту среди здоровых лиц, а также пациентов с подозрением на непереносимость соевого белка. Проведенное сравнение полученных результатов с данными аналогичного обследования с помощью импортного набора показало совпадение результатов исследова-

93

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ния. Данные о высоком, в сравнении со здоровыми, удельном весе лиц с повышенным содержанием исследуемых антител среди пациентов с подозрением на аллергию к сое подтверждают возможность использования данной тестсистемы для диагностики аллергии к указанному продукту.

ВЫВОДЫ

1.Показана возможность исследования антител Е к пищевому аллергену – сое с помощью первой отечественной тест-системы разработанной ООО «Укрмед Дон».

2.У пациентов с клинически обоснованным подозрением на непереносимость соевого белка частота встречаемости повышенного уровня (53,8+8,0%) специфических антител класса IgЕ достоверно выше, чем в группе здоровых.

3. Полученные результаты	свидетельствуют
о необходимости внедрения определения
уровня специфических	иммуноглобулинов

класса Е к сое в дальнейшем при обследовании лиц, страдающих непереносимостью вышеуказанного продукта.

УДК: 616.514-036.12:616.151+577.1

ЛИТЕРАТУРА

1.Лусс Л.В. Этиология, патогенез, проблемы диагностики и лечения аллергического ринита / Л.В. Лусс //Русский медицинский журнал. — 2003. — Т.11, №12. — С.718-729.

2.Sicherer S. H. Food allergy / S. H. Sicherer // Lancet. — 2002. —№360. — P.701-710

3.Cordle Christopher T. Soy Protein Allergy: Incidence and Relative Severity / Christopher T. Cordle // J. Nutr. — 2004. —№134. — P.1213S1219S.

4.Osterballe M. Diagnostic evaluation of food-

related allergic diseases / M. Osterballe, C. Bindslev-Jensen // Journal of Allergy and Clinical Immunology. — 2003. — Vol.112, №1. — P.196-201.

5.Maloney J.M. The use of serum-specific IgE measurements for the diagnosis of peanut, tree nut, and seed allergy / J.M.Maloney, M.Rudengren, S.Ahlstedt et al. //J Allergy Clin Immunol. — 2008. — №122. — P.145-51.

АКТИВНОСТЬ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ -2 И -9 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ КРАПИВНИЦЕ.

А.С. ПРИЛУЦКИЙ, О.М.КУЩ, Д.А ЛЕСНИЧЕНКО.

Донецкий национальный медицинский университет им.М.Горького Кафедра клинической иммунологии, аллергологии и эндокринологии (зав. кафедрой проф. Прилуцкий А.С.)

АКТУАЛЬНОСТЬ

Матриксные металлопротеиназы (MMP) – семейство внеклеточных, цинксодержащих протеиназ. За способность этих ферментов специфически гидролизовать все основные белки матрикса они были названы матриксными металлопротеиназами или матриксинами. MMP синтезируются в виде неактивных проферментов и активируются после отщепления пропептида. Активность MMP в клетке регулируется на разных уровнях, включая транскрипцию, активацию белка и взаимодействие с эндогенными ингибиторами такими как тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP). К настоящему времени описано около 30 MMP. Традиционно MMP классифицируются по субстратной специфичности. В нормальных физиологических условиях они играют центральную роль в процессах морфогенеза, ремоделирования и резорбции

тканей. [1]. ММР принимают участие в деструкции матрикса при ряде заболеваний (пародонтиты, хронические язвы роговой оболочки глаза, а также процессы инвазии и метастазирования опухолей) [1,2,3]. Рядом авторов представлены данные о роли матриксинов в различных областях медицины: кардиологии, гинекологии, нефрологии, аллергологии и других [4-7]. При этом, имеют место немногочисленные работы о значении указанных ферментов в развитии и течении крапивницы, в частности, аутоиммунной [8,9]. В настоящее время продолжается изучение действия ММР на различные патологические процессы.

В связи с вышеизложенным, целью работы было сравнение уровней металлопротеиназ -2 и -9 в сыворотке крови у здоровых лиц и пациентов, страдающих крапивницей. Также в работе было проведено сравнение уровня металлопро-

94

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

теиназ у пациентов с хронической и аутоиммунной крапивницей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы обследовано 20 здоровых лиц, а также 28 пациентов с крапивницей, среди которых 8 человек страдало хронической крапивницей, а у оставшихся двадцати имела место аутоиммунная крапивница. Всем обследованным проводилось определение уровня металлопротеиназ -2 и -9 с помощью наборов для иммуноферментного анализа производства R&D Systems (США). Проводимая при помощи программы «MedStat» статистическая обработка полученного материала включала анализ распределения. Расчитывались среднее значение и его ошибка, использовались параметрические критерии сравнения (Стьюдента).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ:

Сравнение уровня металлопротеиназ у пациентов с крапивницей и здоровых лиц показало, что для пациентов, страдающих аутоиммунной формой заболевания характерно достоверное (р<0,05) повышение как ММР-2, так и ММР-9 (табл.). Так, средние значения указанных цитокинов в сыворотке здоровых лиц составили 224,3+4,7 нг/мл и 62,2+4,0 нг/мл, а у лиц, страдающих аутоиммунной крапивницей – 276,7+15,4 нг/мл и 85,5+6,8 нг/мл соответственной. В то же время, хроническая крапивница сопровождается только достоверным повышением уровня ММР-9. Средние уровни ММР-2 и ММР-9 в данной группе обследованных соста-

вили 244,6+17,6 нг/мл и 89,2+9,7 нг/мл соответственно. При сравнении уровней исследуемых ферментов между пациентами с разными формами крапивницы достоверных различий нами зарегистрированно не было.

Таким образом, установлено, что как хроническая, так и аутоиммунная крапивница сопровождается достоверным повышением концентрации в крови металлопротеиназы-9. Кроме того, для пациентов, страдающих аутоиммунной формой крапивницы также характерно повышение уровня металлопротеиназы-2. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности включения определения матриксных металлопротеиназ -2 и -9 в комплексное обследование лиц с подозрением на хроническую или аутоиммунную крапивницу и, в принципе, согласуется с аналогичными данными, полученными другими исследователями [8,9].

ВЫВОДЫ:

1.Для пациентов с аутоиммунной крапивницей характерно достоверное (р<0,05) повышение концентрации ММР-2 и ММР-9 в сыворотке крови.

2.При хронической крапивнице регистрируется достоверное (р<0,05) повышение содержания ММР-9 в сыворотке.

3.Определение уровней металлопротеиназ может использоваться в комплексной диагностике хронической и аутоиммунной крапивницы.

Таблица

Средние уровни металлопротеиназ

всыворотке здоровых лиц и пациентов

скрапивницей, М+m

			Средний уровень, нг/мл
	Группа обследованных	Кол-во
			ММР-2	ММР-9
	здоровые	20	224,3+4,7	62,2 +4,0
	крапивница	8	244,6+17,6	89,2+9,7*
	аутоиммунная крапивница	20	276,7+15,4*	85,5+6,8*
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с показателями здоровых лиц

ЛИТЕРАТУРА	2. Содержание	матриксных	металлопро-
	теиназ и их	тканевых	ингибиторов в

	1. Соловьева Н.И. Матриксные металлопро-	сыворотке крови и опухолях при их мета-
	теиназы и их биологические функции /
		стазировании / И.В. Кондакова, Е.В. Клишо,
	Н.И. Соловьева. // Журнал Биоорганической
		О.В.Савенкова[идр.]//ВесціНацыянальнай
	химии. — 1998. — №24. — С.217—226.
		акадэміі навук Беларусі. — 2008. — №2. —
		С.88—92.

95

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

3.Влияние активности опухолового процесса на уровень матриксметаллопротеиназ 2 и 9 в моче при раке мочевого пузыря./ Д.И. Данильченко. С. Герхард, К. Юнг [и др.] // Экспериментальная онкология. — 2002. — №3. — С.24.

4.Соколов К.В. Атерогенез и артериальная гипертензия./ К.В. Соколов, С.В. Панькова // Медицинский научный и учебнометодический журнал. — 2007. — №38. — С. 7-19.

5.Клиническое значение и пути фармакологической коррекции экспрессии матриксных металлопротеиназ при аденомиозе./ И.С. Сидорова, А.Л. Унанян, Е.А. Коган [и др.] // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. — 2006 — Т.5,№5. — С.55-61.

6.Роль металлопротеиназ матрикса в развитии диабетической нефропатии. Обзор. /

П.З. Хасигов, С.А. Кцоева, Т.М. Гатагонова [и др.] // Биохимия. — 2000 — Т.65, вып.5.

— С.613-619.

7.Elevated levels of plasma matrix metallo- proteinase-9 in patients with atopic dermatitis: a pilot study / A.C. Devillers, A.W. van Toorenenbergen, G.J. Klein Heerenbrink [et al.] // Clin Exp Dermatol. — 2007 — Vol.32, №3. — С.311-313

8.Increased plasma levels of matrix met- alloproteinase-9 are associated with the

severity of chronic urticaria / A. Kessel,

R.Bishara, A. Amital [et al.] // Clin Exp Allergy.

— 2005 — Vol.35,№2. — С.221-225

9.Altrichter S. Matrix metalloproteinase-9: a novel biomarker for monitoring disease activity in patients with chronic urticaria patients? /

S.Altrichter, N. Boodstein, M. Maurer // Allergy.

— 2009 — Vol.64,№4. — С.652-656.

УДК: 616.127-005.4+616.12-009.72-002:611.018.74

СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО ВОСПАЛЕНИЯ И ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА СО СТАБИЛЬНОЙ СТЕНОКАРДИЕЙ

ГАВРИЛЕНКО Т.И., ЛУТАЙ М.И., ЛОМАКОВСКИЙ А.Н., ПОДГАЙНАЯ Е.А., РЫЖКОВА Н.А., ЯКУШКО Л.В., МИГАЛИНА О.А.

Национальный научный центр «Институт кардиологии им. Н.Д. Стражеско»

По современным представлениям атеросклероз можно рассматривать как хронический воспалительный процесс, который является патогенетической основой формирования атеросклеротической бляшки и дестабилизации уже сформированной атеромы с последующей тромболитической окклюзией сосудов [1, 2, 3].

Вмеханизме развития воспаления и в частности при атеросклерозе участвуют все иммунокомпетентные клетки (ИКК) - лимфоциты, моноциты/макрофаги, нейтрофилы. Кроме ИКК на стадии инициации атеросклеротического процесса активными участниками событий являются эндотелиальные клетки. Они играют важную роль не только в регуляции тонуса сосудов, свертывания крови и фибринолиза, но и во всех фазах острого и хронического воспаления [4].

Впроцессе развития атеросклероза прослеживается активация ИКК, эндотелиальных, гладкомышечных (ГМК) и др. клеток и усиление продукции ими цитокинов, что способствует защите организма уже на начальных фазах воспаления. Но положительная роль этих процессов становится проблематичной в тот момент, когда степень активации перестает быть адекватной и когда первоначально защитный механизм перерастает в патологический процесс, кото-

рый проявляется в виде иммунопатологических реакций (аутоиммунных и/или иммуновоспалительных реакций и др.)

Внастоящее время многие исследователи рассматривают атеросклероз как иммунный ответ на антигены различной природы [3, 4, 5]. Одним из основных аутоантигенов, играющих важную патогенетическую роль в становлении развития атеросклеротических поражений, считаются модифицированные липопротеины низкой плотности (мЛПНП), которые являются пусковым механизмом развития аутоиммунного ответа на липопротеины у человека [3], что ведет к активации иммуновоспалительной реакции (ИВР).

Все перечисленные выше факторы взаимосвязаны между собой, взаимовлияют друг на друга. Однако нет убедительных данных, свидетельствующих о состоянии клеточных и гуморальных факторов системного иммунитета у больных ишемической болезнью сердца (ИБС)

встабильном состоянии.

Всвязи с этим целью работы явилось изучение некоторых клеточных и гуморальных факторов иммунитета, влияющих на развитие иммунного воспаления и аутоиммунной реакции, их взаимосвязь с функцией эндотелия у больных ИБС со стабильным течением.

96

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нами было обследовано 230 больных с хронической ИБС (стабильная стенокардия (СС) напряжения, ІІ-ІV функциональный класс). Средний возраст пациентов составлял 56 (4963) лет. Продолжительность клинических проявлений заболевания – 3 (1-8) лет. Послеинфарктный кардиосклероз наблюдался у 46 % больных. Контрольную группу составили 133 практически здоровых человека 47 (38-60) лет.

Диагноз ИБС устанавливали с учетом клинических проявлений заболевания, объективных признаков перенесенного инфаркта миокарда по данным ЭКГ и эхокардиографии, результатам проб с дозированной физической нагрузкой и данным коронарографии. Диагноз хронической ИБС устанавливали при отсутствии нестабильной стенокардии на протяжении двух последних месяцев и инфаркта миокарда на протяжении последних шести месяцев. В исследование не включали больных с острым и или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими и ревматическими заболеваниями, хронической сердечной недостаточностью ІІБ-

ІІІ стадии, аллергическими заболеваниями, заболеваниями крови.

Параметры иммунологической реактивности включали реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с фитогемагглютинином (ФГА) и антигеном сосудистой стенки [6], поглотительную и метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов (НГ) и моноцитов (Мц) в НСТ-тесте (с учётом их резервных возможностей на пирогенал) [7], уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) [8], содержание холестерола в составе иммунных комплексов (спектрофотометрический метод с использованием набора реактивов для определения холестерола («BioSystems», Испания) [9], уровень аутоантител (ААТ) в сыворотке крови против антигенов тканей (водно-солевых экстрактов) сосудистой стенки или миокарда (реакция потребления комплемента по методике Кондрашовой Н.И), концентрацию иммуноглобулинов (Ig) классов A, M, G в сыворотке крови (метод радиальной иммунодифузии) [7], содержание свободных ААТ к окисленным ЛПНП и в составе циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови ИФА-методом («Biomedica Gruppe», Австрия); концентрацию в супернатанте мононуклеарных клеток (МНК) ИФА-методом провоспалительных цитокинов - ИЛ-6 и ФНО- («ProCon», Россия), ИЛ-2, ИЛ-8, ИФН- («Biosource» Invitrogen Corporation, Канада) и противоспалительного цитокина ИЛ10 («Biosource» Invitrogen Corporation, Канада). Для характеристики степени активности эндотелия определяли концентрацию в плазме крови эндотелина-1: (ИФА тест-системы

„Biomedica Gruppe”, Австрия), и эндотелийзависимую вазодилятацию (ЭЗВД) плечевой артерии, которая проводилась с помощью манжеточной пробы.

Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с помощью программ Microsoft Excel и Statistika 8,0. Вероятность отличий рассчитывали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для независимых выборок). Корреляционный анализ проводили непараметрическим методом с расчетом коэффициента корреляции Спирмена

(R). Отличия между группами считали статистически значимыми при Р меньше 0,05. Данные поданы в виде медианы (Ме), 0,25 и 0,75 персентилей (для ненормального распределения данных).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показали исследования последних лет [3, 4] выдвинутый Н.Н. Аничковым тезис «без холестерина не может бать атеросклероза» не утратил своего значения и сегодня, так как основными носителями холестерина в организме являются липопротеины [10, 11], в частности ЛПНП.

ЛПНП как в крови, так и в стенке артерий модифицируются посредством множественных механизмов, включая оксидацию, энзиматическую деградацию и агрегацию, что вызывает экспрессию провоспалительных генов, ответственных за секрецию провоспалительных цитокинов, лейкоцитоадгезивных молекул и хемокинов, которые вместе обеспечивают адгезию и миграцию клеток воспаления (моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов) в стенку артерий. В работах В.А. Нагорнева и соавт. [10, 11, 12] показано, что при экспериментальном атеросклерозе в крови определяется очень высокий титр антител к различным классам модифицированных ЛПНП. Повышение в крови уровня антител к мЛПНП рассматривается как фактор риска развития атеросклероза и ИБС. Образование при ишемической болезни сердца мЛПНП не только ведет к запуску и развитию иммунного ответа, но и сопровождается формированием аутоиммунного комплекса, включающего в качестве антигена мЛПНП. Эти комплексы захватываются макрофагами как при участии скевенджеррецепторов (SR-AI/II, CD36, CD68, SR-BI, LOX-1, SREC, SR-PSOX), так и через Fc рецепторы с последующим образованием пенистых клеток, которые совместно с ГМК начинают продуцировать коллаген, эластин, глюкозаминогликаны. Это, в свою очередь, вместе с отложением липидов является основой межклеточного соединительнотканного матрикса атеросклеротической бляшки [13].

97

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

По мнению Е.Ф. Чернушенко [14] кроме образования свободных и в составе ЦИК аутоантител к мЛПНП, в организме появляются сенсибилизированные лимфоциты, которые отвечают разными клеточными реакциями при контакте с антигеном – бластообразованием, цитолитическим эффектом, а также выработкой большого количества антител к другим аутоантигенам

(к тканям миокарда, сосудов, легких, щитовидной железы, печени, почек и т.д.). Наличие в организме большого количества сенсибилизированных лимфоцитов, аутоиммунных комплексов и специфических аутоантител ведет к развитию аутоиммунизации, а это может быть пусковым механизмом для активации иммуновоспалительной реакции [15, 16].

									Таблица 1
		Проявление аутоиммунной реакции у больных ИБС
		Показатели				Контрольная группа			Больные ИБС со СС
	ААТ к мЛПНП в сыворотке крови (mU/ml), n = 40					143 (130-171)			257 (152-618)*
	ААТ к мЛПНП в ЦИК (mU/ml) n = 40					27 (16-38)			60 (20-122)*
	РБТЛ к спец. антигенам ткани сосуда (%), n=230					1,3 (0,9-1,7)			5 (3-8)*
	ЦИК (ед. опт. пл.)					75 (55-95)			76 (54-105)
	ХИК (mg/dL)					14 (11-17)			21 (15-24)*
Примечание:		*-достоверность различия между группами, р < 0,05
Наши исследования показали (табл 1.), что					их последующей клональной пролифераци-
у больных ИБС со СС наблюдался высокий уро-					ей и секрецией цитокинов, а также активацией
вень ЦИК, в состав которых входят аутоантитела					В-лимфоцитов и продукцией ими аутоантител
к мЛПНП (+ 370 %), высокий уровень свободных					[11, 12, 19, 20]. Уже на ранних этапах атерогене-
аутоантител к данному аутоантигену (+ 183 %)					за иммунное воспаление начинается с усиления
и высокий уровень холестеринсодержащих им-					адгезии моноцитов к активированным клеткам
мунных комплексов (ХИК) – +60 %.					эндотелия с последующей их трансэндотели-
Проведенный нами корреляционный анализ					альной миграцией под влиянием хемотаксиче-
установил умеренную, но достоверную взаи-					ского агента – моноцитарного хемоаттрактант-
мосвязь между сенсибилизированными к ткани					ного протеина-1 (МСР-1) и дифференциацией
сосудов лимфоцитами и свободными аутоанти-					моноцитов в макрофаги.
телами к мЛПНП (r = 0,25, р<0,05); и с аутоанти-						Вторым профессиональным хемоатрактан-
телами к сосудам (r = 0,3, р<0,05); и с ХИК (r =					том является ИЛ-8. Хотя данный цитокин счи-
0,22, р<0,05). Это свидетельствует о значитель-					тается нейтрофильным хемоаттрактантом, опи-
ной аутосенсибилизации, протекающей как по					саны его индуцирующие потенции в отношении
гуморальному, так и по клеточному типу.					моноцитов, но на более поздних стадиях атеро-
Об участии в атерогенезе фагоцитирующих					генеза [21]. Активированные нейтрофилы, при-
клеток опубликовано немало работ [17, 18]. Так,					влекаемые в очаг воспаления ИЛ-8, участвуют,
макрофаги являются антигенпрезентирующими					как и моноциты в образовании активных форм
клетками (АПК), с их непосредственным участи-					кислорода, усиливающих перекисное окисле-
ем происходит формирование иммунного отве-					ние липидов и белков, а также, секретируя про-
та. Это связано с образованием патогенассо-					теолитические ферменты, способны к разруше-
циированного молекулярного паттерна (РАМР),					нию фиброзного покрова бляшки. ИЛ-8 включа-
который запускает активацию Toll-подобных ре-					ется в процесс адгезии фагоцитирующих клеток
цепторов (TLR) на макрофагах. Через экспрес-					уже на ранних стадиях атерогенеза и является
сируемые TLR макрофаги поглощают мЛПНП и					модулятором		лейкоцитарноэндотелиальных
при участии генов главного комплекса гисто-					взаимодействий [22, 23]. На последующих ста-
совместимости (ГКГ) ІІ класса презентируют					диях атерогенеза ИЛ-8 потенцирует ангиогенез
процессированный пептид			Т-лимфоцитам с		и прогрессирование роста бляшки [24].
									Таблица 2
		Уровень хемоаттрактантов у больных ИБС со СС
		Показатели		Контрольная группа				Больные ИБС со СС
	МСР-1 (мг/л)			74 (62-168)				318 (148-510) *
	ИЛ-8 (пг/мл)			1002 (560-1323)				1588 (1081-2940) *
Примечание:		*-достоверность различия между группами, р<0,05

98

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

Наши исследования показали, что у паци-		Кроме своих выполнения основных задач
ентов ХИБС по сравнению с практически здо-		(адгезии, поглощения, окисления, переварива-
ровыми донорами очень высокое содержание		ния и презентации антигена) эти клетки проду-
МСР-1 в сыворотке крови (на 330 %) и умере-		цируют про- и противовоспалительные цитоки-
но повышенный уровень ИЛ-8 в супернатанте		ны, что способствует запуску и формированию
МНК (на 60%). Это свидетельствует о том, что		иммунного ответа. Цитокины также являются
у больных стабильной стенокардией проявляет		ключевыми факторами, индуцирующие воспа-
свои активационные особенности моноцитар-		лительную реакцию и острофазный ответ орга-
ный хемоаттрактант МСР-1, который находился		низма. Гиперпродукция цитокинов приводит к
в прямой корреляционной зависимости с по-		развитию иммунного воспаления (системного
глотительной активностью моноцитов крови (r =		и/или местного) и может быть причиной разви-
0,35, р<0,045). Несмотря на то, что ИЛ-8 явля-		тия патологических состояний [26, 27].
ется нейтрофильным хемоаттрактантом, нам не		Очень важным для становления значимости
удалось установить достоверную взаимосвязь		иммуновоспалительной реакции у больных ИБС
между ним и функциями нейтрофилов. Однако		различного генеза является ИЛ-2. Индукторами
мы определили умеренную достоверную взаи-		синтеза ИЛ-2 могут выступать как мЛПНП, так и
мозависимость ИЛ-8 с поглотительной активно-		бактерии и вирусы, а также измененные эндо-
стью и внутриклеточным кислородзависимым		телиальные клетки и др. [28]. По своим функ-
метаболизмом моноцитов (r=0,2, р<0,05, r=0,2,		циональным особенностям ИЛ-2 активирует
р<0,015 соответственно).		эффекторные киллерные лимфоциты, продуци-
Хемоаттрактанты МСР-1 и ИЛ-8 формируют		рующие ИФН- и другие провоспалительные ци-
сложную сеть межклеточных взаимодействий в		токины (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО- ), а также макрофаги,
развитии атеросклероза. Это позволяет пред-		повышая их микробицидную способность, гене-
ставить МСР-1 и ИЛ-8 как прогностические		рацию активных форм кислорода и перекиси.
маркеры атеросклероза, как на ранних, так и на		Как видно из табл 3, в группе больных ИБС со
поздних этапах его развития [25].		СС уровень ИЛ-2 значительно превышал дан-
Активированные	фагоцитирующие клетки	ный показатель в группе практически здоровых
участвуют в перекисной модификации ЛПНП,		лиц (на 2025 %).
образуя свободные	радикалы, супероксиды,	Нам не удалось установить взаимосвязь
гидрогенпероксиды,	гидроперекиси и другие	между ИЛ-2 и функцией фагоцитирующих кле-
факторы, от уровня которых зависит количество		ток, но определена прямая достоверная кор-
мЛПНП. Поэтому функциональное состояние		реляционная зависимость между ИФН- и вну-
фагоцитирующих клеток периферической кро-		триклеточным	кислородзависимым метабо-
ви мы оценивали не только по их способности		лизмом Мц и НГ (r=0,25, р<0,05; r=0,4, р<0,01
к фагоцитозу (поглотительная активность), но и		соответственно). То есть ИЛ-2 усиливает гене-
определяли внутриклеточный кислородзависи-		рацию активных форм кислорода нейтрофилов
мый метаболизм НГ и Мц в НСТ-тесте, который		и моноцитов опосредовано, через активацию
отражает уровень продукции клеткой суперок-		Т-лимфоцитов, вырабатывающих большое ко-
сид аниона. Наши исследования показали, что		личество ИФН- .
фагоцитарная активность моноцитов у больных		Значительную роль в дестабилизации ате-
СС не отличалась от показателей практически		росклеротической бляшки как мы уже гово-
здоровых лиц и составила 35 (30-39) % против		рили, играет хроническое воспаление, в ме-
33 (25-36) % (р = 0,03). Также как и кислородза-		ханизме развития которого ключевую роль
висимый метаболизм этих клеток – 13 (9-17) %		отводят Т-лимфоцитам [3]. Активированные
против 12 (9-15)% (р=0.46). Но при этом функ-		Т-лимфоциты,	способные продуцировать
циональный резерв моноцитов у больных СС		ИФНбыли определены в нестабильных ате-
был существенно ниже – 27 (9-50) % против 48		росклеротических бляшках более 15 лет назад.
(25-67) % (р = 0,0001). Поглотительная актив-		Интерферон- (ИФН- ) имеет цитотоксический и
ность нейтрофилов также не отличалась от по-		цитостатический эффект на большинство кле-
казателей контрольной группы – 59 (45-77) %		точных линий in vitro, за счет активации макро-
против 50 (25-82)% (р=0,3). Тогда как кислород-		фагов, нейтрофилов и естественных киллер-
зависимый метаболизм этих клеток был досто-		ных клеток, которые сами способны синтези-
верно выше у больных СС по сравнению с груп-		ровать ИФН- , ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО- .
пой доноров – 53 (43-64)% против 32 (24-40)%		Вследствие этого данные клетки приобретают
(р=0,0001), а функциональный резерв клеток		свойства лизировать неопластические и вирус-
достоверно ниже – 13 (1-24)% против 29 (31-		инфицированные клетки. Кроме того ИФНин-
60)% (р=0,0001), что свидетельствует об исто-		дуцирует экспрессию антигенов ГКГ І и ІІ класса
щении функциональных возможностей фагоци-		на клетках-мишенях, что повышает их распозна-
тирующих клеток у больных ИБС со СС.		вание цитотоксическими Т-лимфоцитами. Он

99

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

усиливает экспрессию молекул адгезии на эн-				Одним из основных цитокинов, который
дотелиоцитах и лейкоцитах, повышает чувстви-				может лежать в основе развития хронической
тельность клеток к другим цитокинам, активи-				ишемической болезни сердца, является ИЛ-6.
рует продукцию белков острой фазы воспале-				Считают, что ИЛ-6 является провоспалитель-
ния. В работах Tеllides et all., [29] показано, что				ным цитокином, который повышает синтез бел-
введение ИФНэкспериментальным животным				ков острой фазы воспаления печенкой: СРБ,
приводила к активации атеросклероза. Значи-				амилоида А, гаптоглобина, фибриногена, ком-
тельное усиление атерогенеза наблюдалось в				понентов комплемента. Данные факторы запу-
результате генетического нарушения контроля				скают каскад локальных и системных воспали-
за активацией Т-лимфоцитов. У данных живот-				тельных реакций. ИЛ-6 регулирует активность
ных наблюдалась выраженная воспалительная				ингибиторов	матриксных металлопротеиназ,
реакция за счет гиперактивации Т-лимфоцитов				потому от его уровня зависит содержание в ко-
и чрезмерной продукции одного из основных				ронарных поражениях белков внеклеточного
цитотоксических цитокинов – ИФН- , что сопро-				матрикса. Повышенный уровень ИЛ-6 в стенках
вождалось ранним развитием и нестабильным				коронарных артерий ассоциируется с прогрес-
течением атеросклеротического процесса. Ре-				сированием атеросклероза, ростом бляшек и
зультаты наших исследований (табл. 3) показа-				их трансформацией в осложненные коронар-
ли, что у больных ИБС со стабильной стенокар-				ные повреждения [31]. Как видно из таблицы 3,
дией уровень секреции мононуклеарными клет-				высокое содержание ИЛ-6 в супернатанте МНК
ками ИФНочень высок. Его уровень на 1100 %				определено нами в общей группе больных ИБС
выше, чем у практически здоровых лиц.				со стабильной стенокардией по сравнению с
Важное значение в формировании разви-				показателями в группе доноров и было выше на
тия иммуновоспалительной реакции отводится				202%. Гиперсекреция ИКК как ФНО- , так и ИЛ-6
провоспалительному цитокину ФНО- . Основная				может рассматриваться как маркер персисти-
иммунобиологическая роль его лежит в стиму-				рующего воспаления в атеросклеротически из-
ляции пролиферации Т- и В-лимфоцитов, ин-				мененной коронарной артерии, которое сохра-
дукции секреции ИЛ-2 и ИФН- , усилении про-				няется в период стабильного течения ИБС, и,
дукции супероксидов, активации синтеза белков				вероятно, может определять предрасположен-
острой фазы. ФНОможет принимать участие				ность и быть угрозой разрыва атеросклеротиче-
в развитии и прогрессировании воспаления,				ской бляшки [4].
микрососудистой гиперкоагуляции, дисфункции				Важным регуляторным фактором иммунного
эндотелия, ремоделировании сердца, гемоди-				воспаления	является противовоспалительный
намических нарушениях и метаболического ис-				ИЛ-10, так как он угнетает клеточный иммуни-
тощения при различных заболеваниях человека				тет, стимулируя гуморальный. Стимулирует про-
как инфекционного, так и неинфекционного про-				лиферацию В-лимфоцитов, тимоцитов и тучных
исхождения [30 ]. Как показывают полученные				клеток, угнетая функцию Т-хелперов-1 типа, НК,
нами данные (табл. 3) у больных ХИБС уровень				моноцитов/макрофагов, понижает синтез ИЛ-1,
ФНОсекретируемого МНК значительно превы-				ИЛ-2, ИЛ-8, ИФН- и ФНО- .
шал показатели в группе доноров (на 283 %).
						Таблица 3
Уровни цитокинов в супернатантах мононуклеаров больных стабильной стенокардией
	Показатели		Контрольная группа			Больные ИБС со СС
	ИФН- (пг/мл)		0,9 (0,1-4,2)			11,5 (3,6-92,5)*
	ИЛ-2 (пг/мл)		2,2 (1,8-2,6)			105 (13,2-203,0)*
	ИЛ-10 (пг/мл)		116 (24-156)			194 (21-758)*
	ФНО- (пг/мл)		53 (28-80)			203 (80-614)*
	ИЛ-6 (пг/мл)		756 (27-1300)			2280 (1400-3880)*

Примечание: *-достоверность различия между группами, р<0,05

100