immunologia_N3-4_2010_block_210x297

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

Уровень ИЛ-10 секретируемого МНК у части больных (25 %) находился в пределах физиологической нормы, либо ниже ее (35 %), либо незначительно превышал (у 40 %) данный показатель в группе доноров, что говорит о дисбалансе в системе про- и противовоспалительных цитокинов, когда на фоне гиперсекреции МНК ИЛ-2, ИФН- , ФНО- , ИЛ-6 средний уровень ИЛ10 в группе больных ИБС был незначительно выше данного показателя в группе доноров. После проведения корреляционного анализа нами была установлена обратная достоверная взаимосвязь между противовоспалительным ИЛ-10

ипровоспалительными факторами: ФНО- (r= - 0,55, р<0,01); ИЛ-6 ( r= - 0,52, р<0,01); ИЛ-2 (r= -0,5, р<0,05). Это указывает на то, что у обследуемых нами лиц противовоспалительного ИЛ-10 недостаточно для снижения уровня воспаления.

Полученные нами результаты дают основание утверждать, что развитие иммунного ответа на образование мЛПНП активирует иммунокомпетентные клетки, секретирующие провоспалительные цитокины. Об этом мы можем судить после проведения корреляционного анализа, когда была установлена прямая взаимосвязь между сенсибилизированными тканью сосудов

имиокарда лимфоцитами и маркерами иммунного воспаления: ИЛ-2 (r = 0,25, р < 0,05), ИЛ-6 (r = 0,32, р < 0,05), и ИФН- (r = 0,25, р < 0,05).

Кроме того, модифицированные ЛПНП свободные и в составе иммунных комплексов, а также ИКК (Лф, Мц/Мф) являются основными факторами, стимулирующими активацию эндотелия. Эндотелиальные клетки, в свою очередь, взаимосвязываясь с Т-лимфоцитами стимулируют их миграцию в интиму и секретируют различные провоспалительные пептиды (интерлейкины, хемоаттрактанты, ростовые факторы), молекулы адгезии, эндотелины и др. При этом Т-лимфоциты могут оказывать контактнозависимое цитотоксическое действие на эндотелий, вызывая апоптоз этих клеток. В поддержании сосудистого тонуса и в аутопаракринной регуляции роста и дифференцировки тканей активное участие принадлежит пептиду, который секретируют эндотелиальные клетки сосудов

– эндотелин -1 (ЭТ-1) [32]. Секрецию ЭТ-1 из клеток стимулируют ИЛ-1, адреналин, ФНО- , ионы кальция и другие гуморальные факторы. Кроме того увеличивается секреция ЭТ-1 под действием гипоксии и стресса. ЭТ-1 обладает выраженной митогенной активностью в отношении клеток эндотелия и ГМК, а также способен вызывать экспрессию молекул адгезии на эндотелиальных клетках [33].

Как показали наши исследования у больных со стабильной ИБС выявлен значительно повышенный уровень эндотелина-1 по сравне-

нию с группой практически здоровых лиц: 2,9 (0,3-11,0) против 0,3 (0,1-0,4) пг/мл (на 867 %) на фоне умеренно сниженной эндотелийзависимой вазодилятации (ЭЗВД) при проведении манжеточной пробы: 7,2 (3,9 – 8,5) против 10,0 (8,9 – 12,4) % (на –28 %) относительно референтных значений.

Большая концентрация ЭТ-1 может привести к активации экспрессии рецепторов на ГМК, стимулируя тем самым стойкую вазоконстрикцию [34]. Тогда как у практически здоровых лиц уровень ЭТ-1 не превышал 0,4 пг/мл (физиологическая концентрация), что способствовало воздействию на эндотелиальные рецепторы вызывая высвобождение факторов релаксации.

Можно утверждать, что у больных с ИБС со стабильной стенокардией имеет место значительная активация (относительно секреции ЭТ-1) и умеренная дисфункция эндотелия (по манжеточной пробе).

ЭТ-1 в высоких концентрациях способен активировать ИКК, которые в свою очередь секретируют провоспалительные цитокины (ФНО- , ИФН- ), а они могут переводить эндотелий из антитромболитического состояния в тромболитическое, так как провоспалительные цитокины стимулируют синтез прокоагулянтных белков [4].

Проведенный нами корреляционный анализ подтвердил взаимосвязь эндотелиальных и иммунокомпетентных клеток: между ЭТ-1 и ФНО- (r= 0,2; р<0,05), ЭТ-1 и ИФН- (r= 0,4; р<0,05), ЭТ-1 и метаболической активностью Мц и НГ (r= 0,3; r= 0,2; р<0,05).

ВЫВОДЫ

1.У больных ХИБС со стабильным течением определен очень высокий уровень аутоантител к модифицированным ЛПНП как свободных, так и в составе ЦИК. Кроме того, установлено значительно повышенное число сенсибилизированных к ткани сосудов лимфоцитов, которые прямо коррелировали с маркерами иммунного воспаления (ИЛ-2, ИЛ-6, ИФН- , поглотительной активностью нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов).

2.При хронической ИБС со стабильным течением установлена активная аутоиммунная реакция, протекающая как по клеточному, так и по гуморальному типу, проявление которой взаимосвязано и зависит от функционального состояния фагоцитирующих клеток, неспособных на данном этапе развития атерогенеза к удалению из организма большого количества свободных и в составе ЦИК аутоантител к модифицированным ЛПНП.

3.У больных СС установлена эндотелиальная дисфункция, которая выражалась в высоких

101

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

концентрациях эндотелина-1 на фоне сниженной эндотелийзависимой вазодилятации при проведении манжеточной пробы. Выявлена прямая достоверная корреляционная связь между функцией эндотелиальных клеток (эндотелин-1) и ИКК (ФНО- , -интерферон, метаболическая активность моноцитов и нейтрофилов). Это свидетельствует о том, что эндотелиальные клетки не только способны активно продуцировать провоспалительные белки, но и влияют на секреторную активность ИКК.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1.Климов А. Н., Никульчева Н. Г. Обмен липидов и липопротеинов и его нарушения. СПб.: Наука, 1999.

2.2. Фрейдлин И. С, Шейнин Ю. А. Эндотелиальные клетки в качестве мишеней и продуцентов цитокинов // Мед. иммунол. – 2001. – № 4. – С. 499 – 514.

3.3. Hansson G. K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease // N. Engl. J. Med.

– 2005. – V. 352. – P. 1685 – 1695.

4.4. Яицкий Н. А., Шляхто Е.В., Петрищев Н.Н. Иммуновоспалительные аспекты атеросклероза // Медицинский академический журнал. – 2007. – №1. – С. 30 – 37.

5.5. Libby P. Inflammation in atherosclerosis // Nature. – 2002. – V. 420 – P. 868 –874.

6.6. Стефани Д.Ф. Клиническая иммунология и иммунопатология детского возраста / Стефани Д.Ф., Вельтищев Ю.Е. – М.: Медицина, 1996. – 372 с.

7.7. Унифицированные иммунологические методы обследования больных на стационарном и амбулаторном этапах лечения: Метод. рекомендации / Киевский НИИ фтизиатрии и пульмонологии (Чернушенко Е.Ф., Г.Н. Дранник, Ю.А. Гриневич и др. ) – К.: 1988. – 18 с.

8.8. Digeon M., Cazer M., Riza J. Detection of immune complexes in human sera by simplified assays with polyethyleneglycol // Immunol. Methods. – 1977. – V.226. – P. 497 – 509.

9.9. Уразгильдеева С.А., Шаталина Л.В., Денисенко А.Д. и др Взаимосвязь между уровнем холестеринсодержащих иммунных комплексов и чувствительностью липопротеидов к перекисному окислению у больных ишемической болезнью сердца // Кардиология. – 1997. – № 10. – С. 17 – 20.

10.10. Нагорнев В.А., Восканьянц А.Н. Современные представления о патогенезе атеросклероза // Вестник Рос. АМН. – 2006.

– №9-10. – С. 66 – 72.

11.11. Нагорнев В.А., Мальцева СВ. Аутоиммунныеивоспалительныемеханизмы развития атеросклероза // Архив патол. – 2005. – Т. 67, №5. – С. 6 –15.

12.12. Нагорнев В.А. Патогенез атеросклероза. - СПб.: Наука, 2006. - 187 с.

13.13. Guyton J. R., Klemp K. F. Development of the lipid-rich core in human atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. – 199. – V.16.

– P. 4 – 11.

14.14. Чернушенко Е.Ф. Аутоиммунизация и и ее клиническое значение // Мистецтво лікування – 2007. – № 6 – С.55 – 57.

15.15. Гавриленко Т.И., Мхитарян Л.С., Гавриш А.С. и др. Иммунное реагирование и интенсивность оксидативного стресса у больных ишемической болезнью сердца // Иммунология та алергология. – 2009. – № 2-3. – С. 59 – 67.

16. 16. Гавриленко Т.И., Волошина О.В., Ломаковський А.М. Лутай М.И. Сенсибилизация лимфоцитов к тканям сосудистой стенки как проявление аутоиммунного типа иммунного ответа у пациентов с хроническими формами ишемической болезни сердца // Укр. ревматолог. ж. – 2008.

–№3. – С. 38 – 41.

17.17.ЛутайМ.И.,ЛомаковскийА.Н.,Абуталипов Р.Ф. Клеточный состав фиброзного покрова стабильных и нестабильных атеросклеротических бляшек венечных артерий // Укр. кард.ж. – 2004. – №6. – С. 20 – 24.

18.18. Jaffer F.A., Libby P., Weissleder R. Molecular and cellular imaging of atherosclerosis // J.Am. Col.Card. – 2006. – V.47. – P. 1328 – 1338.

19.19. Mandal К., Jahangiri M., Xu Q. Autoimmunue mechanisms of atherosclerosis // HEP. – 2005.

–170. – P. 715 – 736.

20.20. Sherer Y., Shoenfeld Y. Mechanisms of disease: atherosclerosis in autoimmune diseases // Nat. Clin. Pract. Rheumatol. – 2006.

–V.2. – P. 99 – 106.

21.21. Мehra V.C., Ramgolam V.S., Bender J.R. / Cytokines and cardiovascular disease // J. Leukoc. Biol. – 2005. – V.78. – P. 805 – 818.

22.22. Gerszten R.E., Garcia-Zepeda Е.А., Lim Y.C. et al. MCP-1 and IL-8 trigger firm adhesion of monocytes to vascular endothelium under flow condition // Nature. – 1999. – V.398. – P. 718 – 723.

23.23. Yue T.L., Wang X., Sung C.P. et al. IL-8. A mitogen and chemoattractant for smooth muscle cells // Circ. Res. – 1994. – V.75. – P. 1 – 7.

24.24. Simonini A., MoscucciM., Muller D.W. et al. IL-8 is an angiogenic factor in human coronary

102

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

atherectomy tissue // Circulation. – 2000. – V.

101.– P. 1519 –1526.

25.25. Apostolakis S., Vogiatzi К., Amanatidou V., Spandidos D.A. IL-8 and cardiovascular disease // Cardiovasc. Res. – 2009. – V.84. – P. 353 –

26.26. Воробьев А.А. (2006) Цитокины (интерфероны, интерлейкины и др.). В кн.: А.А. Воробьев, А.С. Быков, А.В. Караулов (ред.) Иммунология и аллергология (цветной атлас): учебное пособие для студентов медицинских вузов. Практическая медицина, Москва, с. 50 – 57.

27.27. Гавриленко Т.И., Корнилина Е.М., Якушко Л.В., Ткач Н.А. Особенности функционального состояния мононуклеаров периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Иммунология и аллергология. – 2005. – №2. – С. 38 – 41.

28.28. Симбирцев А.С. Интерлейкин-2 и рецепторный комплекс интерлейкина-2 в регуляции иммунитета. // Иммунология. – 1998. – №6. – С. 3 – 8.

29.29. Tellides G, Tereb D.A., Kirkiles-Smith S C. et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes // Nature. – 2000.

– V. 403. – P. 207 – 211.

30.30. Sharma R., Coats A.J., Anker S.D. The role of inflammatory mediators in chronic heart failure: cytokines, nitric oxide, and endothelin-1 // Int. J. Cardiology. – 2000 – V.72 . – P. 175 – 186.

31.31. Ikeda U., Hojo Y., Katsuki T. et al. Procoagylant and proinflammatory activity in acute coronary syndromes // Cardiovasc. Res.

– 1999. – V. 42. – P. 823 – 830.

32.32. Suzuki T., Kumazaki T. Mitsui Y, Endothehn-1 is produced and secreted by neonatal rat cardiac myocytes in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1993. – V. 191. – P. 823 –

33.33. Визир А.Д., Визир А.Е., Березин А.Е. Иммунная и воспалительная активация как новая концептуальная модель формирования и прогрессирования сердечной недостаточности (обзор литературы) // Журнал АМН Украины. -2000. – Т.6, № 2. – С. 264-278.

34.34. Бахтияров Р.З. Современные методы исследования функции эндотелия // Рос. кард. ж. – 2004. – №2. – С. 75 – 79.

РЕЗЮМЕ

СТАН ІМУННОГО ЗАПАЛЕННЯ ТА ФУНКЦІЇ ЕНДОТЕЛІЮ У ХВОРИХ

З ІШЕМІЧНОЮ ХВОРОБОЮ СЕРЦЯ ЗІ СТАБІЛЬНОЮ СТЕНОКАРДІЄЮ

Гавриленко Т.І., Лутай М.І., Ломаківський О.М., Підгайна О.А.,

Рижкова Н.О., Якушко Л.В., Мігаліна О.О.

При обстеженні 230 хворих зі стабільним перебігом хронічної ішемічної хвороби серця були визначені фактори, що формують активну аутоімунізацію та імунозапальну реакцію, а також виражену дисфункцію ендотелію. Визначали функціональну активність лімфоцитів в реакції бласттрансформації з фітогемагглютиніном, а також ступінь сенсибілізації клітин до тканин судин. ІФА-методом визначали рівень прозапальних цитокінів в супернатантах мононуклеарних клітин - ІЛ-6, ФНП- , ІЛ-2, ІЛ-8, ІФН- , прозапального ІЛ-10, а також и концентрацію в плазмі крові ендотеліна-1.

Встановлена кореляційна залежність між маркерами запалення та сенсибілізованими до тканини судин лімфоцитами,яківизначаютьаутоімуннуреакцію,щопротікає по клітинному типу. Визначена ендотеліальна дисфункція, яка була виражена у високих концентраціях ендотеліна-1 на фоні зниженої ендотелійзалежної вазодилатації при проведенні манжеткової проби. Встановлений прямий вірогідний зв'язок між функцією ендотеліальних та імунокомпетентних клітин свідчить про взаємостимуляцію секреторної здатності прозапальних цитокінів.

Ключові слова: ішемічна хвороба серця, аутоімунізація, імунозапальна реакція, дисфункція ендотелію.

SUMMARY

THE STATE OF IMMUNE INFLAMMATION AND FUNCTION OF ENDOTHELIA OF THE PATIENTS WITH ISCHEMIC HEART DISEASE WITH A STABLE STENOCARDIA

GavrilenkoT.I., Lutay M.I., Lomakovskiy O.M., E.A. Podgainaya,

RizhkovaN.O., Yakushko L.V., Migalina O.A.

At an inspection 230 patients with the stable flow of chronic ischemic heart disease determined factors, forming active autoimmune and inflammatory reaction, and also the expressed dysfunction of endothelia. Cross-correlation dependence was set between the markers of inflammation and sensibilized lymphocytes to tissue of vessels, which determine autoimmune reaction, flowing on a cellular type. The level of cytokines (IL-6, IL-8, IL-10, TNF- . INF- ) and endothelin-1 were determine by IFA-methods.

Endothelial dysfunction which was expressed in the high concentrations of endothelin-1 on a background reduced endotheliumdependend vasodilatation during the lead through of cufftest was set. Direct reliable connection was set between a function endothelial and immunocompetent cells testifies to mutual stimulation of secretory ability of proinflammatory cytokines.

Key words: ischemic heart disease, autoimmunization, inflammation, dysfunction of endothelium

103

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

УДК: 612.017.1:591.891:616-092.9.259

ДИНАМІКА ІМУННОЇ ВІДПОВІДІ НА АЛОТА ТКАНИННІ АНТИГЕНИ ФЕТАЛЬНИХ НЕЙРОКЛІТИН В ЕКСПЕРИМЕНТІ

ЛІСЯНИЙ М.І., ЛЮБИЧ Л.Д.

ДУ «Інститут нейрохірургії ім.акад.А.П.Ромоданова АМН України»

Питання про можливу здатність алогенних нейральних стовбурових клітин (НСК) та нейральних клітин-прекурсорів (НКП) викликати імунну активацію у віддаленому періоді після трансплантації залишається до кінця не вирішеним і потребує поглиблених досліджень. Дані щодо імуногенних властивостей НСК in vivo є неоднозначними, дискусійним залишається питання про експресію антигенів гістосумісності НСК та НКП. Є свідчення того, що НСК людини розпізнаються і викликають імунну відповідь в ало- і ксеногенних системах ex vivo, тобто вони мають хоч і низький імунологічний потенціал, але його рівень достатній для активації периферичних лімфоцитів реципієнта [20].

Нашими попередніми дослідженнями встановлена можливість експресії антигенів гістосумісності на рівні мРНК та протеїновому рівні нейроклітинами людини різного терміну гестації [4,5,7]. Наступним етапом досліджень було вивчення антигенності та імуногенності фетальних НКП в експерименті in vivo.

Метою даної роботи було порівняльне дослідження імунної відповіді у мишей при системному введенні клітин лімфовузлів, що повноцінно експресують антигени гістосумісності, та фетальних НКП (термін гестації 13-15 діб), експресія якими антигенів гістосумісності є низькою; а також можливість пригнічення викликаної імунної відповіді.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

Матеріалом для дослідження слугували: 1) НКП мишей СВА (Е13-15); 2) клітини лімфовузлів дорослих мишей СВА; 3) клітини лімфовузлів дорослих мишей-реципієнтів C57Вl/6; 4) сироватка периферичної крові дорослих мишейреципієнтів C57Вl/6.

Усі роботи з експериментальними тваринами проводилися з дотриманням Закону України “Про захист тварин від жорстокого поводження», «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються з експериментальною та іншою науковою метою», а також принципів біоетики та норм біологічної безпеки.

Отримання клітинних суспензій. Отримання суспензій НКП з мозку мишей 13-15 доби ембріонального розвитку проводили за методикою, описаною раніше [1]. Суспензії лімфоцитів отримували з лімфовузлів (n=6) мишей шляхом механічної гомогенізації тканини лімфовузлів у

середовищі RPMI з подальшим відмиванням і підрахунком клітин з 3% розчином СН3СООН та 0,2% розчином трипанового синього.

Внутрішньоочеревинне введення клітин.

Дослідження розвитку імунних реакцій проводили при внутрішньоочеревинному введенні клітин лімфовузлів дорослих тварин та фетальних НКП (Е13-15) на лінійних мишах. Контролем слугували інтактні тварини. Всього досліджено 110 тварин.

Різні типи клітин від мишей-донорів СВА вводили внутрішньоочеревинно мишамреципієнтам С57BL/6 у кількості 1х106 клітин на тварину.

Експериментальних тварин розділили на групи:

1)внутрішньоочеревинне введення клітин лімфовузлів дорослих тварин;

2)внутрішньоочеревинне введення фетальних НКП (Е13-15).

У кожній групі тварин була підгрупа, тваринам якої проводили імуносупресію сандімуном (100 мкг на тварину на 0-у,3-у,6-у добу).

Через 6, 12, 18 та 37 діб після введення клітин проведено дослідження алоімунних та антигенспецифічних реакцій. З цією метою визначали цитотоксичну активність імунокомпетентних клітин лімфовузлів реципієнтів та цитотоксичну активність алоантитіл стосовно клітин лімфовузлів донорів, а також рівень аутоантитіл до нейроспецифічних антигенів в сироватках реципієнтів.

Дослідження цитотоксичної активності імунокомпетентних клітин МТТколориметричним методом. В якості клітинефекторів використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-реципієнтів С57BL/6 експериментальних груп. В якості клітин-мішеней використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-донорів СВА. Співвідношення ефектормішень складали 5:1. Цитотоксичний тест проводили за протоколом, описаним раніше [3]. Цитотоксичність виражали цитотоксичним індексом (ЦІ) у відсотках:

Де ОГе+м – значення оптичної густини в лунках ефектори+мішені; ОГе – значення оптичної густини в лунках з ефекторами; ОГм – значення оптичної густини в лунках з мішенями.

104

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

Дослідження цитотоксичної активності алоантитіл МТТ-колориметричним методом. В якості клітин-мішеней використовували лімфоцити лімфовузлів мишей-донорів СВА, які інкубували в присутності сироваток мишей-реципієнтів С57BL/6 експериментальних груп з додаванням комплементу морської свинки (1:10) 24 год при 370С. Використовували розведення сироваток 1:10. Завершення реакції та реєстрацію результатів проводили за протоколом,описаним раніше [3]. Цитотоксичність виражали ЦІ у відсотках:

Де ОГс+м - значення оптичної густини в лунках сироватка+мішені; ОГм - значення оптичної густини в лунках з мішенями.

Дослідження гуморальних аутоімунних реакцій до нейроспецифічних білків (НСБ).

Рівень аутоантитіл до НСБ (ОБМ, S-100, NSE) в сироватках тварин експериментальних груп визначали твердофазним імуноферментним методом із використанням для тест-систем самостійно отриманих і стандартизованих НСБ [6].

Математична обробка отриманих результатів проводилася з використанням пакету статистичних програм «Microsoft Office Excel 2003».

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Встановлено, що на 6-у добу після внутрішньоочеревинного введення клітин в обох досліджуваних групах достовірно зростала цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів мишей-реципієнтів С57BL/6 у МТТ-тесті стосовно лімфоцитів лімфовузлів мишейдонорів СВА (р<0,0007 у порівнянні з контролем) (рис.1,А). В наступні терміни ці показники знижувались з 12-ї по 37-у добу (р<0,004 у порівнянні з контролем). При цьому в групі тварин, яким було введено лімфоцити дорослих мишей-донорів, цитотоксична активність лімфоцитів в усі терміни спостереження була вища, ніж у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15): у групі тварин із внутрішньоочеревинним введенням фетальних НКП (Е13-15) цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів достовірно відрізнялась від аналогічного показника тварин з введенням лімфоцитів лімфовузлів на 6-у (р<0,007), 18-у (р<0,0001) та 37-у добу (р<0,016). Призначення сандімуну дозволило знизити показники алоцитотоксичної активності у групах тварин із введенням лімфоцитів на 12-18-у добу (р<0,03 та р<0,014 відповідно) після імунізації.

	90						90
	80						80
	70						70
	60						60
%	50					%	50
ЦІ,	40					ЦІ,	40
	30						30
	20						20
	10						10
	0						0
	0	6	12	18	37	доба
			1	2	3

0	12	18	37	доба
1а	2а	3а		3

Рис.1. Цитотоксична активність імунокомпетентних клітин при внутрішньоочеревинному введенні клітин: (цитотоксична активність лімфоцитів лімфовузлів мишей-реципієнтів C57Bl/6 стосовно лімфоцитів лімфовузлів мишей-донорів CBA (МТТ–тест,%))

1в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів

1а в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів + імуносупресія

2в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів

2а в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуносупресія

3контроль С57BL/6 (інтактні)

3а контроль С57BL/6 (інтактні) + імуносупресія

105

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

При дослідженні сироватки периферич-	37-у добу cпостереження рівень алоантитіл у
ної крові мишей-реципієнтів С57BL/6 у МТТ-	титрі 1:10 залишався підвищеним в обох дослі-
тесті стосовно лімфоцитів лімфовузлів мишей-	джених групах (р<1,45х10-11, р<0,019 відповід-
донорів СВА в титрі 1:10 встановлено зростання	но). Корекція сандімуном знизила вказані по-
цитотоксичного індексу алоантитіл на 6-12-у	казники до 37-ї доби cпостереження у тварин із
добу в обох групах (р<0,019), який утримував-	введенням лімфоцитів лімфовузлів та феталь-
ся на високому рівні протягом 12-ї – 18-ї доби,	них НК. Таким чином, можна констатувати, що
і наступне його зменшення з 18-ї по 37-у добу	в периферичній крові тварин через місяць після
(р<0,03) (рис.2). У групі тварин з внутрішньоо-	внутрішньоочеревинного введення різних типів
черевинним введенням лімфоцитів дорослих	клітин реєструється залишковий рівень алоци-
мишей досліджений показник був вищим, ніж у	тотоксичних антитіл у титрі 1:10, який можна
тварин із введенням фетальних НКП. Проте на	знизити призначенням сандімуну.

	80						80
	70						70
	60						60
	50						50
ЦІ,%	40					ЦІ,%	40
	30						30
	20						20
	10						10
	0					доба	0
	0	6	12	18	37
		1	2		3

0	6	12	18	37	доба
	1а		2а	3

Рис.2. Цитотоксичний індекс сироватки периферичної крові (титр 1:10) мишей-реципієнтів C57Bl/6 стосовно лімфоцитів лімфовузлів мишей-донорів CBA при внутрішньоочеревинному

введенні клітин (МТТ–тест,%):

1в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів

1а	в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів + імуносупресія

2в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів

2а	в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуносупресія

3контроль С57BL/6 (інтактні)

	При дослідженні рівня аутоантитіл до не-	пі дещо зменшило рівень анти-S-100-антитіл у
	йроспецифічних антигенів встановлено, що рі-	цей термін.
	вень аутоантитіл до ОБМ (рис.3,А) у групі тва-	Аналіз динаміки рівня аутоантитіл до NSE
	рин з внутрішньоочеревинним введенням лім-	показав, що у групі тварин з внутрішньоочере-
	фоцитів лімфовузлів практично не відрізнявся	винним введенням лімфоцитів лімфовузлів він
	від показників інтактних тварин. У групі тварин	практично не відрізнявся від показників інтак-
	із введенням фетальних НКП рівень аутоантитіл	тних тварин. У мишей із введенням фетальних
	до ОБМ зростав на 18-у добу (р<0,05), в подаль-	НКП рівень аутоантитіл до NSE достовірно зни-
	шому незначно знижуючись до 37-ї доби спо-	жувався на 12-18-у добу, в подальшому підви-
	стереження. Застосування сандімуну у цій групі	щуючись до контрольних значень до 37-ї доби
	дозволило знизити рівень анти-ОБМ-антитіл на	спостереження (рис.3,В).
	37-у добу до норми.	ОБГОВОРЕННЯ
	Рівень аутоантитіл до S-100 у групі тварин
		Отримані нами результати свідчать, що клі-
	із введенням лімфоцитів коливався відносно
	контрольних значень, достовірно їх не переви-	тинні алоцитотоксичні імунні реакції мають місце
	щуючи. У групі тварин із введенням фетальних	при внутрішньоочеревинному введенні як клітин
	НКП рівень аутоантитіл до S-100 на 6-у добу	лімфовузлів дорослих тварин, так і фетальних
	дослідження достовірно знижувався відносно	НКП (Е13-15). Алоцитотоксичні клітинні реакції
	контролю, а в подальші терміни підвищувався,	максимально проявляються на 6-у добу після
	зростаючи вище норми на 37-у добу (р<0,05)	імунізації, в подальшому поступово достовірно
	(рис.3,Б). Застосування сандімуну у цій гру-	знижуючись до 37-ї доби. Найвищий рівень ало-

106

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

А
	25,00						25,00
	20,00						20,00
.	15,00					.	15,00
ум .од	10,00					ум .од	10,00
	5,00						5,00
	0,00						0,00					37L адоба
	0Lа	6La	12L	а	18L а	37L а доба	0Lа	6La	12L	а	18L а
		1		2	3			1а		2а	3а	3
Б
	18,00						18,00
	16,00						16,00
	14,00						14,00
	12,00						12,00
						.	10,00
.одум	8,00					.одум
	10,00
							8,00
	6,00						6,00
							4,00
	4,00
							2,00
	2,00
							0,00
	0,00						0Lа	6La	12L	а	18L а	37L а
	0Lа	6La	12L	а	18L а	37L адоба						доба
		1		2	3			1а			2а	3
В
	20,00						20,00
	18,00						18,00
	16,00						16,00
	14,00						14,00
							12,00
	12,00					.
.одум						.одум	8,00
	10,00						10,00
	8,00						6,00
	6,00
							4,00
	4,00
							2,00
	2,00
							0,00
	0,00						0Lа	6La	12L	а	18L а	37L а
	0L а	6La	12L	а	18L а	37L а						доба
		1		2	3	доба	1а	2а			3а	3

Рис.3. Рівень аутоантитіл до нейроспецифічних білків в сироватках периферичної крові мишейреципієнтів C57Bl/6 при внутрішньоочеревинному введенні клітин мишей-донорів CBA (ум.од.): А – до ОБМ; Б - до S-100; В - до NSE.

1в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів

1а в/очеревинне введення лімфоцитів СВА донорів + імуносупресія

2в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів

2а в/очеревинне введення нейроклітин Е13-15 СВА донорів + імуносупресія

3контроль С57BL/6 (інтактні)

3а контроль С57BL/6 (інтактні) + імуносупресія

107

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

цитотоксичних клітинних реакцій зареєстровано у тварин, яким було введено лімфоцити дорослих мишей-донорів, дещо нижчим цей показник був у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15).

На наш погляд, розвиток клітинних алоцитотоксичних реакцій імунітету на 6-у добу після внутрішньоочеревинного введення алогенних фетальних НКП (Е13-15) свідчить про наявність антигенів комплексу гістосумісності на фетальних НК, що необхідно враховувати при клінічній нейротрансплантації. При цьому рівень експресії антигенів гістосумісності фетальними НК є, вочевидь, нижчим, ніж на імунокомпетентних клітинах (лімфоцитах лімфовузлів), проте достатнім для генерації алоцитотоксичної клітинної відповіді. Не дивлячись на те, що в науковій літературі не існує усталеної думки щодо експресії антигенів МНС I i II класів нейральними СК, значна кількість дослідників виявили експресію антигенів гістосумісності І та ІІ класу НСК та НПК людини [9,14,17-19]. Ці дані узгоджуються з отриманими нами раніше результатами, де показана можливість експресії антигенів гістосумісності на рівні мРНК та протеїновому рівні нейроклітинами людини різного терміну гестації [4,5,7]. Як відомо, мембранні антигени МНС I класу забезпечують взаємодію антигенпрезентуючих клітин з CD8+ Т-лімфоцитами, а антигени МНС IІ класу – з СD4+ Т-лімфоцитами; отже, наявність на НСК та НПК антигенів гістосумісності І та ІІ класу забезпечує розпізнавання алогенних детермінант як природними кіллерами та цитотоксичними лімфоцитами, так і Т-лімфоцитами- хелперами. При цьому, крім представлення антигену за допомогою антигенпрезентуючих клітин лімфатичних вузлів реципієнта, не можна виключати прямого представлення антигену МНС ІІекспресуючими НКП фетального мозку, що вводяться реципієнту.

З 12-ї доби реєструвалось зниження алоцитотоксичної клітинної відповіді реципієнтів на алоантигени мишей-донорів. Можна припустити, що на цю ланку імунної відповіді введені НКП (Е13-15) чинили імуносупресивний вплив, що фіксувався вже на 12-у добу після введення клітин, можливість якого підтверджена даними інших дослідників [14-16]. Зокрема, у роботі [15] показано за допомогою магнітно-резонансної візуалізації, що при внутрішньовенному введенні НПК останні не потрапляли в ЦНС, а транзиторно виявлялись у лімфовузлах та селезінці, де вони пригнічували активацію та проліферацію Т-клітин і значно знижували їх імуногенність. На нашу думку, схожий механізм може реалізуватись при внутрішньоочеревинному введенні фетальних НКП.

Так, Fainstein N. et al. (2008) [16] встановили, що НПК пригнічували in vitro індукцію маркерів активації Т-клітин (IL-2R- , PD-1, CTLA) та про-

ліферацію Т-клітин у відповідь на стимули, опосередковані Т-клітинним рецептором, а також пригнічували проведення сигналу прозапальних цитокінів в імуноцитах.

Цікавим у цьому плані є дослідження Akesson E. еt al.(2009) [14]. Автори досліджували у порівнянні алогенну імунну відповідь на НСК, астроцити та нейрони. За їх даними, астроцити експресували молекули як МНС І класу, так і МНС ІІ класу, на тому ж рівні, що і НСК, тоді як нейрони – тільки МНС І молекули. НСК та астроцити, але не нейрони, виявляли супресивний ефект на алогенну імунну відповідь.

Особливості динаміки клітинних алоімунних реакцій після введення фетальних НК можуть пояснюватись кількома механізмами:

–безпосередньою взаємодією НСК чи НКП з Т-лімфоцитами, яка призводить до клональної анергії чи апоптозу останніх через відсутність костимулюючого сигналу від костимуляторних молекул;

–секрецією НСК біологічно активних сполук із імуносупресивною дією;

–супресивною дією CD4+CD25+Foxp3+ регуляторних Т-лімфоцитів, здатних пригнічувати алоспецифічні Т-лімфоцити, що розглядаються як засіб індукції імунологічної толерантності до алотрансплантатів для попередження гострого та хронічного відторгнення трансплантатів [9].

Унаших дослідах при внутрішньоочеревинному введенні клітин розвивались гуморальні алоцитотоксичні імунні реакції, досягаючи максимуму на 12-18-у добу і знижуючись з 18-ї по 37-у добу дослідження. Через місяць після внутрішньоочеревинного введення різних типів клітин реєструвався залишковий рівень алоцитотоксичних антитіл у титрі 1:10, який вдалося знизити призначенням сандімуну.

Поряд з алоцитотоксичною гуморальною відповіддю, нами досліджено також нейроаутоімунні гуморальні реакції. Слід вказати, що на відміну від досить значного рівня цитотоксичних алоспецифічних антитіл, ми не зафіксували значущого рівня тканинноспецифічних аутоантитіл до НСБ у експериментальних тварин при внутрішньоочеревинному введенні клітин.

Як і можна було очікувати, у тварин з введенням лімфоцитів дорослих донорів рівні аутоантитіл до всіх досліджених НСБ не відрізнялись від контролю у всі терміни спостереження.

Угрупі тварин із введенням фетальних НКП рівень аутоантитіл до ОБМ зростав на 18-у добу,

вподальшому незначно знижуючись до 37-ї доби спостереження. Динаміка рівнів аутоантитіл до S-100 та NSE була іншою: рівень аутоантитіл до S-100 на 6-у добу був нижчим за контроль, а в подальші терміни підвищувався, зростаючи вище норми на 37-у добу; рівень аутоантитіл до

108

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

NSE був нижчим за контроль на 12-18-у добу, в подальшому підвищуючись до контрольних значень до 37-ї доби спостереження.

За даними літератури, вміст НСБ збільшується в процесі дозрівання структур мозку у ссавців і корелює з функціональним розвитком нервової тканини [8]. Наприклад, S-100 в мозку ембріонів людини з’являється у спинному, довгастому, середньому мозку, мості та мозочку

увіці 10-15 тижнів пренатального онтогенезу, а в корі переднього мозку ідентифікується тільки

увіці 30 тижнів і його вміст корелює з появою електричної активності цієї зони [8]. Вважають, що період експоненціального зростання НСБ в онтогенезі співпадає із закінченням проліферації, диференціювання та початком функціонування клітин [8]. Виходячи з вищевикладеного, НКП з фетального мозку миші 13-15 доби гестації експресують досліджувані НСБ на рівні, достатньому для індукції гуморальної аутоімунної відповіді.

Як відомо, в нормальних умовах у інтактних організмів НСБ присутні у сироватці крові у низьких концентраціях внаслідок природної загибелі нейроклітин [12], а також існує базовий низький рівень природних аутоантитіл до власних НСБ; в нормі підтримується динамічна рівновага між рівнями НСБ та відповідними специфічними аутоантитілами. Можна припустити, що при внутрішньоочеревинному введенні фетальних НКП частина клітин потрапляє у лімфовузли та селезінку, де вони контактують з антигенпрезентуючими клітинами та індукують специфічні антитілопродукуючі клітини; тоді як інша частина клітин гине, вивільняючи НСБ, які зв’язуються циркулюючими природними аутоантитілами, і таким чином відтерміновують наростання титрів нейроаутоантитіл, чим пояснюється розвиток нейроаутоімунної гуморальної відповіді у більш пізній термін (18-37-а доба), ніж алоцитотоксичної (6-18-а доба), а також зменшення нижче контролю рівнів аутоантитіл до S-100 (6-а доба) та NSE (12-18-а доба) .

Таким чином, після внутрішньоочеревинного введення клітин нами зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ (18-а доба) та S-100 (37-у доба) у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15), що свідчить про потенціальну можливість розвитку нейроспецифічних аутоімунних реакцій після внутрішньоочеревинного введення попередників НК. Очевидно, контакт фетальних НКП (Е13-15) з антигенпрезентуючими клітинами реципієнта веде до індукції специфічних антитілопродукуючих клітин.

Застосування імуносупресії сандімуном дозволило знизити рівень анти-ОБМ-антитіл на 37-у добу до норми, та дещо зменшити рівень анти-S-100-антитіл у цей термін. Як відомо, циклоспорин А (Сандімун для парентерального

введення) - циклічний поліпептид з вираженою імуносупресивною дією, який пригнічує розвиток реакцій клітинного типу і Т-залежне утворення антитіл. В наших дослідженнях застосування циклоспорину А сприяло зменшенню проявів імунних реакцій алогенного та нейроаутоімунного спрямування.

Таким чином, при внутрішньоочеревинному введенні фетальних нейроклітин індукуються алоцитотоксичні клітинні та гуморальні реакції, а також імунна відповідь до специфічних нейроантигенів. Застосування імуносупресорного препарату сандімун дозволяє послабити прояви реакцій клітинного алоімунітету та рівень гуморальної сенсибілізаці при введенні в організм клітин ембріонального та фетального мозку.

ВИСНОВКИ

1.Клітинні алоімунні реакції розвиваються з 6-ї по 37-у добу після внутрішньоочеревинного введення фетальних НКП (Е13-15) з максимальним рівнем на 6-у добу і подальшим зниженням до 37-ї доби. Інтенсивність клітинної алоімунної відповіді на фетальні НКП є нижчою за відповідь на клітини лімфовузлів дорослих тварин.

2.При внутрішньоочеревинному введенні всіх досліджуваних типів клітин гуморальні алоімунні реакції наростають до 12-ї доби і мають різну інтенсивність в залежності від типу введених клітин: більш високий рівень алоантитіл зареєстровано у групі тварин із введенням клітин лімфовузлів дорослих тварин, достовірно нижчий - у групі тварин із введенням фетальних НКП (Е13-15).

3.Після системного введення клітин нами зафіксовано підвищений рівень антитіл до ОБМ (18-а доба) та S-100 (37-у доба) у тварин з введенням фетальних НКП (Е13-15), що свідчить про потенціальну можливість розвитку нейроспецифічних аутоімунних реакцій після внутрішньоочеревинного введення попередників НК.

4.Імуносупресивний препарат сандімун гальмує клітинну алоімунну та, частково, аутоімунну відповідь на системне введення алогенних фетальних НКП при використанні триразового введення препарату в дозі 100 мкг.

5.Фетальні НКП розпізнаються і викликають клітинну та гуморальну імунну відповідь в алогенній системі in vivo, інтенсивність якої нижча у порівнянні з відповіддю на лімфоцити, що свідчить про значно менший рівень експресії антигенів гістосумісності фетальними НКП, але цей рівень достатній для активації периферичних лімфоцитів реципієнта та індукції алоімунної відповіді.

109

ІМУНОЛОГІЯ ТА АЛЕРГОЛОГІЯ: НАУКА І ПРАКТИКА. 3-4’2010

ЛІТЕРАТУРА

1.Зозуля Ю.А., Лисяный Н.И., Любич Л.Д., Грищенко В.И., Петренко А.Ю., Бабийчук Г.А. Длительное культивирование in vitro криоконсервированных и нативных

нейроклеток эмбрионов человека // Укр. Нейрохірургічний журнал.-2003.-№ 2.- С.11-14.

2.Кузовкова Н.А. Оценка активности естественных киллеров колориметрическим методом // Иммунология.-1991.-№4.-С.59-61.

3.Лісяний М.І., Любич Л.Д. Особливості розвитку імунної відповіді на внутрішньо мозкове введення алогенних фетальних нейроклітин в експерименті // Імунологія та алергологія.- 2009.-№4.- С.99-109.

4.Лісяний М.І., Любич Л.Д., Семенова В.М., Стайно Л.П., Главацький О.Я., Висоцький М.С. Дослідження експресії антигенів HLA нейроклітинами людини різного терміну гестації in vitro // Імунологія та алергологія.- 2008.-№ 1.-С.14-19.

5.Лісяний М.І., Любич Л.Д., Семенова В.М., Главацький О.Я., Стайно Л.П., Висоцький М.С., Потапова А.І. Експресія антигенів гістосумісності нейроклітинами людини різного терміну гестації in vitro // Трансплантологія.- 2008.-Т.10, № 1.-С.125-129.

6.Лісяний М.І., Любич Л.Д., Черченко А.П., Верхоглядов Ю.П. Дослідження рівня аутоантитіл до нейроспецифічних білків у кролів після алогенної внутрішньомозкової трансплантації ембріональних клітин-попередників нервової системи // Фізіологічний журнал.- 2006.-т.52, № 3.-С.64-69.

7.Любич Л.Д., Лисяный Н.И., Семенова В.М., Стайно Л.П. HLA-антигенная характеристика нативных и культивируемых нейроклеток фетального и постнатального головного мозга человека // Клеточные культуры. Информационый бюлетень. Выпуск 25.-Спб.: Изд-во Политехн. ун-та, 2010.- С.47-59.

8.Никандров В.Н., Чаплинская Е.В. Протеин S-100: структурно-функциональные свойства и роль в нервной ткани // Біополімери і клітина.-2005.-Т.21, №1.-С.12-27.

9.Полтавцева Р.А., Марей М.В., Дубровина И.В. и др. Анализ развития стволовых нейральных клеток человека in vitro // Цитология. Cуtology.-2001.-Т.43, № 9.-С.884-885.

10. Сергеев	В.С. Предотвращение остро-
го и хронического отторжения транс-
плантатов у мышей адоптивным введе-
нием	CD4+CD25+Foxp3+ регуляторных

Т-лимфоцитов. Клеточная трансплантация и тканевая инженерия 2008; 3: 39-42.

11.Тейлор П., Томас Д., Миллз К.

Культивирование линий и клонов Т-клеток in vitro //В.кн. «Лимфоциты. Методы» П/р Дж.Клауса.-М.: «Мир».-1990.- С.208-229.

12.Чехонин В.П., Лебедев С.В., Гурина О.И. и др. Элиминация нейроспецифических белков из ЦНС (патогенетические и методические аспекты) // Вестник Российской АМн.- 2006.-№6.-С.3-12.

13.Шпакова А.П., Павлова К.С., Булычева Т.И.

МТТ-колориметрический метод определения цитотоксической активности естественных киллерных клеток // Клин.лаб. диагностика.-2000.-№ 2.-С.20-23.

14.Akesson E., Wolmer-Solberg N., Cederarv M. et al. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response // Stem Cell Res.- 2009.- 2(1).-P.56-67.

15.Ben-Hur T. Immunomodulation by neural stem cells. J.Neurol.Sci. 2008; 265(1-2): 102-104.

16.Fainstein N., Vaknin I., Einstein O. et al. Neural precursor cells inhibit multiple inflammatory signals // Mol.Cell Neurosci. -2008.-39(3).- P.335-41.

17.Modo M., Mellodew K., Rezaie P. In vitro expressionofmajorhistocompatibilityclassIand class II antigens by conditionally immortalized murine neural stem cells //Neurosci Lett.- 2003.-Vol.337(2).-P.85-88.

18.Odeberg J., Piao J.H., Samuelsson E.B. et al.

Low immunogenicity of in vitro-expanded human neural cells despite high MHC expression

//J.Neuroimmunol.-2005.-Vol.161, No 1-2.- P.1-11.

19.Poltavtseva R.A., Marey M.V., Aleksandrova M.A. et al. Evaluation of progenitor cell cultures from human embryos for neurotransplantation

//Brain Res.Dev.Brain Res.-2002.-Vol.134, № 1-2.-P.149-154.

20.Ubiali F., Nava S., Nessi V. et al. Allorecognition of human neural stem cells by peripheral blood lymphocytes despite low expression of MHC molecules: role of TGF-beta in modulating proliferation. Int.Immunol. 2007; 19(9): 10631074.

110