6 курс / Клинические и лабораторные анализы / Лабораторная_диагностика_туберкулеза_Ерохин_В_В_ред_

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ СЛУШАТЕЛЯ

использованием автоматизированных и полуавтоматизированных систем» тема 5.1. «Пробоподготовка, особенности культивирования, выделения культур и идентификации на автоматизированных и полуавтоматизированных системах», а также модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.4 «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза».

В ходе практического занятия планируется разобрать следующие вопросы:

•рабочий алгоритм и протокол пробоподготовки различных диагностических материалов;

•культивирование, выделение и идентификация культур МБ

•стерильность материалов и причины контаминации;

Цель – дать слушателям практические навыки пробоподготовки, культивирования выделения и идентификации культур при работе на автоматизированных системах.

Рекомендуемая литература

1.Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство. Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.

2.Kent P.T., Kubica G.P. Public health mycobacteriology: guide for the level III laboratory. Atlanta, GA, USA: US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control. – 1985. – P. 57–63.

3.Siddiqi S H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.

4.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.

5.Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Culture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

Тема 5.2. Изучение лекарственной чувствительности на автоматизированных и полуавтоматизированных системах

Количество аудиторных часов – 1.

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. Учитываются знания, полученные на лекциях, семинарских занятиях, а также базовые знания, полученные на этапе самоподго-

638

товки модуля 5 «Методы выявления возбудителя туберкулеза и определения лекарственной чувствительности с использованием автоматизированных и полуавтоматизированных систем» тема 5.2. «Изучение лекарственной чувствительности на автоматизированных и полуавтоматизированных системах», а также модуля 1. «Основные биологические характеристики микроорганизмов рода Mycobacterium» темы 1.4 «Обзор микробиологических методов изучения микроорганизмов рода Mycobacterium и их место в диагностике туберкулеза».

В ходе практического занятия планируется разобрать:

•протокол постановки тестов лекарственной чувствительности Цель – дать слушателям практические навыки постановки те-

стов лекарственной чувствительности при работе на автоматизированных системах.

	Рекомендуемая литература
	1.	Приказ МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003 г. «О совершенствовании
		противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.
	2.	Попов С.А., Пузанов В.А., Siddiqi S.,Rusch-Gerdes S. Руководство.
		Система BD BACTEC MGIT 960 – новый «золотой» стандарт в
		диагностике туберкулеза // FIND diagnostics. – 2007. – 23 с.	ЗАНЯТИЯМ
	3.	Rusch-Gerdes S., Domehl C., Nardi G. et al. Multicenter evaluation
		of the mycobacteria growth indicator tube for testing susceptibility of
		Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs // J Clin Microbiol. –	ПРАКТИЧЕСКИМ
		1999. – № 37. – Р. 45–48.
	4.	Rusch-Gerdes S., Pfyffer G. E., Casal M. et al. Multicenter labora-
		tory validation of the BACTEC MGIT 960 technique for testing sus-
		ceptibilities of Mycobacterium tuberculosis to classical second-line
		drugs and newer antimicrobials // J. Clin. Microbiol. – 2006. – №	К
		44. – Р. 6886–6892.
			МАТЕРИАЛЫ
	5.	Siddiqi S H. MGIT procedure manual for BACTEC MGIT 960 TB
		system. Sparks, MD, USA: Becton Dickinson. – 2005. – p 81–84.
	6.	Siddiqi S., Rusch-Gerdes S. Руководство по работе с системой
		BACTEC MGIT 960 // FIND diagnostics. – 2006. – 74с.	МЕТОДИЧЕСКИЕ4.Раздел
	7.	Siddiqi S., Rusch-Gerdes S., Alexander H. et al. MGIT Procedure
		Manual. For BACTEC MGIT 960 TB System (Also applicable for
		Manual MGIT) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) Cul-
		ture and Drug Susceptibility Demonstration Projects – 2007.

639

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ СЛУШАТЕЛЯ

Модуль 8. Молекулярные методы в кластерном анализе микобактерий туберкулеза

Тема 8.5. «Применение методов молекулярной* эпидемиологии для решения клинических задач»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – формирование у слушателей умений и навыков описания сполиготипов и расчета коэффициента трансмиссии на основании типирования штаммов МБТ по ПДРФ IS6110.

В упражнениях отрабатываются навыки:

–описания сполиготипа в виде бинарного кода;

–описания сполиготипа в виде октального (восьмеричного)

кода;

–перевода одного варианта кодирования сполиготипов в дру-

гой;

–расчета коэффициента трансмиссии штаммов.

Примерная структура практического занятия по теме 8.5. «Применение методов молекулярной эпидемиологии для решения клинических задач» предполагает разделение занятия на 2 части, каждая из которой посвящается решению конкретной задачи.

Рекомендуемая литература

1.Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Проблемы туберкулеза и болезни легких. – 2006. – №1. – С. 29–35.

2.Черноусова Л.Н., Карачунский М.А. Молекулярная эпидемиология туберкулеза // Проблемы туберкулеза. – 2007. – № 4. – С. 3–7.

3.Brudey K., Driscoll J., Rigouts L. et al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology // BMC Microbiol. – 2006. – Vol. 6. – P. 23.

* Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

640

Модуль 9. Молекулярно-генетические методы для выявления микобактерий туберкулезного комплекса и НТМБ

Тема 9.3. «Методология проведения ПЦР анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – знакомство с особенностями постановки ПЦР-анализа для выявления ДНК микобактерий.

Практическое занятие проводится в интерактивной форме. При разработке плана проведения практического занятия учитываются базовые знания, закладываемые на этапе самоподготовки.

Входе практического занятия планируется разобрать:

•Особенности выделения ДНК МБТ

•Условия амплификации ДНК МБТ

•Детекция продуктов ПЦР

Рекомендуемая литература

1. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и соавт. ПЦР «в реальном времени». Под ред. Д.В. Ребрикова, – изд 2-е, испр. и доп. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний. – 2009. – 223 с.

Тема 9.4. «Разнообразие тест-систем для детекции результатов ПЦР-анализа»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – знакомство с разнообразием ПЦР тест-систем.

Входе практического занятия планируется разобрать:

•Тест-системы с электрофоретическим анализом результатов

•Тест-системы для проведения ПЦР в режиме реального времени

•Особенности основных тест-систем для ПЦР-диагностики туберкулеза Практическое занятие проводится в интерактивной форме.

При разработке плана проведения практического занятия учитываются базовые знания, закладываемые на этапе самоподготовки.

Рекомендуемая литература

1.Aslanidis C., Nauck M., Schmitz G. High-speed prothrombin GA 20210 and methylenetetrahydrofolate reductase C-T 677 mutation detection using real-time fluorescence PCR and melting curves // BioTechniques. – 1999. – Vol. 27. – P. 234–238.

Раздел 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

641

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ СЛУШАТЕЛЯ

2.Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays // J Mol Endocrinol.

–2000. – Vol. 25(2). – P. 169–193.

3.Feinberg M., Fernandez S., Cassard S., Bertheau Y. Quantitation of 35S promoter in maize DNA extracts from genetically modified organisms using real-time polymerase chain reaction, part 2: interlaboratory study. JAOAC Int. – 2005. – Vol. 88(2). – P. 558–573.

4.Giulietti A., Overbergh L., Valckx D., Decallonne B., Bouillon R., Mathieu C. An overview of real-time quantitative PCR: applications to quantify cytokine gene expression // Methods. – 2001. – Vol. 25(4). – P. 386–401.

5.Lay M.J. Wittwer C.T., Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid-cycle PCR // Clin Chem. – 1997. – Vol. 43(12). – P. 2262–2267.

6.Schmittgen T.D. Real-time quantitative PCR. Methods. – 2001. – Vol. 25(4). – P. 383–385.

7.Walker N.J. A Technique whose time has come // J. Science. – 2002.

–Vol. 296. – P. 557–559.

Модуль 10. Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий

Тема 10.2. «Методы, позволяющие дифференцировать виды* микобактерий внутри туберкулезного комплекса»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – знакомство с методами идентификации микобактерий внутри туберкулезного комплекса, формирование у слушателей базовых навыков проведения кластерного анализа сполиготипов штаммов M.tuberculosis и M.bovis.

Входе практического занятия планируется разобрать:

•анализ результатов сполиготипирования штаммов M.tuberculosis

иM.bovis

•ДНК-стриповая технология идентификации M.tuberculosis complex.

•ПЦР-тест-системы для идентификации микобактерий внутри туберкулезного комплекса Практическое занятие проводится в интерактивной форме.

Планируется использовать следующие методы: решение задач идентификации штаммов микобактерий внутри туберкулезного

* Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

642

комплекса, разбор профилей сполиготипирования клинических изолятов M.tuberculosis.

При разработке плана проведения практического занятия учитываются базовые знания слушателей, закладываемые на этапе самоподготовки.

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова Н.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с

2.Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. – № 3. – С. 64–66.

3.Мороз А.М., Макарова М.В., Краснова М.А. Сравнительные данные применения высокоэффективной жидкостной хроматографии для идентификации микобактерий, выделенных на жидкой и плотной питательных средах // Туберкулез и болезни легких. – 2009. – № 8. – С. 49–51.

4.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. – СПб: Медицинская пресса. – 2005. – 224 с.

5.Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

6.Хоулт Дж., Криг Н. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Том 2. Изд. Мир, 1997. – 368 с.

7.Cook V.J., Turenne C.Y., Wolfe J., Pauls R., KabaniA. Conventional methods versus 16S ribosomal DNA sequencing for identification of Nontuberculous Mycobacteria: Cost Analysis // J. Clin. Microbiol. – 2003. – Vol. 41. – P. 1010–1015.

8.Kox L.F., van Leeuwen J., Knijper S., Jansen H.M., Kolk A.H. PCR assay based on DNA coding for 16S rRNA for detection and identification of mycobacteria in clinical samples // J. Clin. Microbiol. – 1995. – Vol. 33 (12) – P. 3225–3233.

9.Lee A.S., Jelfs P., Sintchenko V., Gilbert G.L. Identification of nontuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing.

//J. Med. Microbiol. – 2009. – Vol. 58. – P. 900–904. 10.Mahillon J., Chandler M. Insertion Sequences // Microbiology and

Molecular Biology Reviews. – 1998. – P. 725–774.

11.Park H., Jang H., Kim Ch., Chung B., Chang Ch.L., Park S.K., Song S. Detection and identification of Mycobacteria by amplification of the internal transcribed spacer regions with genusand species-spe-

Раздел 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

643

РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ СЛУШАТЕЛЯ

cific PCR primers // J. Clin. Microbiol. – 2000. – Vol. 38. – P. 4080– 4085.

12.Russo C., Tortoli E., MenichellaD. Evaluation of the New GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial Species // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P. 334–339.

13.Said H.M., Ismail N., Osman A., Velsman C., Hoosen A.A. Evaluation of TBc identification immunochromatographic assay for rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex in samples from broth cultures // J. Clin. Microbiol. – 2011. – Vol. 49 (5). – P. 1939– 1942.

14.Shitikov E., Ilina E., Chernousova L., Borovskaya A., Rukin I., Afanas’ev M., Smirnova T., Vorobyeva A., Larionova E., Andreevskaya S., Kostrzewa M., Govorun V. Mass spectrometry based methods for the discrimination and typing of mycobacteria // J. Infection, Genetics and Evolution. – 2012. – Vol. 12. – P. 838–845.

15.Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes; Approved Standards. – M 24-A. – Vol. 23. – №18.

16.Thibault V.C., Grayon M., Boschiroli M.L., Hubbans C., Overduin P., Stevenson K., Gutierrez M.C., Supply Ph., Biet F. New VariableNumber Tandem-Repeat markers for typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M.avium Strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length Polymorphism typing. Published ahead of print 30 May 2007, doi: 10.1128/JCM.00476-07.

17.Zolg J.W., Philippi-Schulz S. The superoxide dismutase gene, a target for detection and identification of mycobacteria by PCR // J.Clin. Microbiol. – 1994. – Vol. 32. – P. 2801–2812.

Тема 10.4. «Методы,* применяемые для видовой идентификации НТМБ»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – формирование у слушателей современного представления о методах идентификации (базовых и новейших).

В ходе практического занятия планируется разобрать:

•Методы, применяемые для идентификации представителей рода Mycobacterium (традиционные микробиологические, моле- кулярно-генетические)

•ДНК-стриповая технология

•Протеомный анализ методом масс-спектрометрии Практическое занятие проводится в интерактивной форме.

Планируется использовать следующие методы: решение задач по

644

выбору методов идентификации штаммов микобактерий, разбор ситуаций, которые могут возникнуть в лабораторной практике.

При разработке плана проведения практического занятия учитываются базовые знания, закладываемые на этапе самоподготовки, а также получаемые при прослушивании лекций и семинаров модуля 10. "Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий".

Рекомендуемая литература

1.Литвинов В.И., Макарова Н.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. – М.: МНПЦБТ. – 2008. – 256 с.

2.Оттен Т.Ф., Васильев А.В. Микобактериоз. – СПб: Медицинская пресса. – 2005. – 224 с.

3.Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации»

4.Lee A.S., Jelfs P., Sintchenko V., Gilbert G.L. Identification of nontuberculous mycobacteria: utility of the GenoType Mycobacterium CM/AS assay compared with HPLC and 16S rRNA gene sequencing. //J. Med. Microbiol. – 2009. – Vol. 58. – P. 900–904.

5.Richter E., Rьsch-Gerdes S., Hillemann D. Evaluation of the GenoType Mycobacterium Assay for Identification of Mycobacterial Species from Cultures // J. Clin. Microbiol. – 2006. – Vol. 44. – P. 1769–1775.

6.Shitikov E., Ilina E., Chernousova L., Borovskaya A., Rukin I., Afanas’ev M., Smirnova T., Vorobyeva A., Larionova E., Andreevskaya S., Kostrzewa M., Govorun V. Mass spectrometry based methods for the discrimination and typing of mycobacteria // J. Infection, Genetics and Evolution. – 2012. – Vol. 12. – P. 838–845.

7.Susceptibility testing of Mycobacteria, Nocardiae and other aerobic Actinomycetes; Approved Standards. – M 24–A. – Vol. 23. – №18.

Модуль 11. Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий

Тема 11.2. «Молекулярно* -генетические методы определения ЛУ МБТ»

Количество аудиторных часов – 2

Входе практического занятия планируется разобрать:

•Секвенирование генов МБТ, ответственных за устойчивость к ПТП

•Биочиповая технология

* Демонстрационный материал к семинару представлен на диске. Может быть распечатан в качестве раздаточного материала.

Раздел 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

645

•ДНК-стриповая технология

•Аллель-специфическая ПЦР

Практическое занятие проводится в форме дискуссии на тему ускоренного определения лекарственной чувствительности МБТ молекулярно-генетическими методами. Практическое занятие будет разделено на 2 части, продолжительностью по часу, каждая из которых посвящена отдельной проблеме.

При разработке плана проведения практического занятия учитываются базовые знания, закладываемые на этапе самоподготовки, а также получаемые при прослушивании лекций и семинаров модуля 11. «Молекулярно-генетические основы резистентности микобактерий» темы 11.2. «Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ» семинарского занятия модуля 11 «Молеку- лярно-генетические основы резистентности микобактерий» темы 11.2. «Молекулярно-генетические методы определения ЛУ МБТ».

Цель практического занятия 1 – формирование у слушателей современного представления о методах детекции мутаций в геноме микобактерий, отвечающих за возникновение лекарственной устойчивости к ПТП, описание достоинств и ограничений каждого метода.

Цель практического занятия 2 – формирование у слушателей представлений о комплексном подходе к определению ЛЧ микобактерий туберкулезного комплекса.

		Рекомендуемая литература
		1. Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Варламов Д.А., Алексеев
		Я.И. Применение метода ПЦР в реальном времени для опреде-
		ления и контроля за распространением лекарственно-устойчи-
		вых штаммов микобактерий туберкулеза // Проблемы туберку-
		леза и болезни легких. – 2008. – №4. – С. 38–44.
		2. Mikhailovich V., Lapa S., Gryadunov D., Sobolev A., Strizhkov B.,
		Chernyh N., Skotnikova O., Irtuganova O., Moroz A., Litvinov V.,
	СЛУШАТЕЛЯ	Vladimirskii M., Perelman M., Chernousova L., Erokhin V., Zase-
		datelev A., Mirzabekov A. Identification of rfampin-resistant My-
		cobacterium tuberculosis strains by hybridization, PCR, and ligase de-
		tection reaction on oligonucleotide microchips // J. Clin. Microbiol.
	ТЕТРАДЬ	– 2001. – Vol. 39. – P. 2531–2540.
		3. Smirnova, EY Nosova, OI Skotnikova, LN Chernousova, AM
		Moroz, AS Zasedatelev, and VM Mikhailovich. Detection of muta-
	РАБОЧАЯ	tions in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to
		fluoroquinolones by hybridization on biological microchips. Bull Exp
		Biol Med, 2008; 145(1): 108–13.

646

4.Vasylieva I.,Samoilova A., Larionova E., Chernousova L. Impact of rapid diagnostics of M.tuberculosis drug resistance by GenoType MTBDRplus GenoType MTBDRsl (Hain Lifescience GmbH, Germany) on efficacy of treatment of MDR/XDR TB patients // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2012. – Vol. 185. – A3313.

Модуль 12. Организация лаборатории молекулярногенетических методов исследований

Тема 12.4. «Соблюдение правил биобезопасности при работе в лаборатории молекулярно-генетических исследований»

Количество аудиторных часов – 1

Цель практического занятия – формирование у слушателей умений и навыков деконтаминации, обеззараживания помещений и оборудования, предотвращения биологической аварии в лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот.

Входе занятия будут получены практические умения по деконтаминации поверхностей и оборудования. В упражнениях отрабатываются навыки предотвращения биологической аварии

Входе практического занятия рассматриваются вопросы:

•практика проведения обеззараживания, деконтаминации рабочих поверхностей и приборов;

•приемы обработки механических пипеток;

•техника предотвращения биологической аварии. Практическое занятие проводится в интерактивной форме, что

позволит наглядно продемонстрировать действия по соблюдению правил биологической безопасности в лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот.

Рекомендуемая литература

1.Руководство "Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях" Р 3.5.1904-04. – М.: 2005.

2.Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" СП 1.3.2322-08, Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2008.

3.Санитарные правила и нормы "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" СанПиН 2.1.7.728-99, Минздрав России, 1999.

Раздел 4. МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

647