26. Основные принципы культивирования микроорганизмов. Характеристика.

Принципы культивирования микроорганнзмов. С момента внесения микробов (засева) в питательную среду имеет место индукция их физиологической активности, особенно — в логарифмическую и/или стационарную фазы размножения. При этом одновременно сопряженно протекают многие реакции, катализи-руемые иммобилизованными или свободными ферментами. В реакции, особенно — на первых зтапах, нередко вовлекаются высокомолокулярные вещества с определенной конфигурацией молекул (сравнить такие источники утлерода как глюкоза и крахмал или источники азота—аммония сульфат, какая-либо аминокислота и нативный белок). Поэтому следует учитывать специфику выращивания микроорганизмов.

Главные особеиности культивирования микробов в целях получения большинства первичиых и вторичных метаболитов следующие;

1. необходимость применения специальных биореакторов вместимостью 63, 200, 1000 и более м³, в которых возможно поддержание асептических условий в течение сравнительно длительного времени;

2. видовые различия биообъектов, с которыми связаны специфические характеристики питательных сред, кардииальные точки (минимальные, оптимальные и максимальные) температуры и рН;

3. невозможность одновременного поддержания постоянства критериев химического, теплового, диффузионного и гидродинамического подобия, с чем связаны трудности масштабирования биотехнологических процессов;

4. различия в массообмеиных процессах у аэробов и анаэробов — культивирование аэробов осуществляют в трехфазных системах ["твердое тело (клетки)-жидкость-газ"], анаэробы выращивают в виде двухфазных систем ["твердое тело (клетки)-жидкость"];

5. необходимость неремешивания культуральньгх жидкостей в целях улучшения массообмена (кислорода воздуха для аэробов — прежде всего), а это, в свою очередь, индуцирует пенообразование и, как следствие, диктуетнеобходимость прибегать к пеногашению;

6. микроорганизмы чувствительны к воздействию механических, физических и химических факторов;

7. при микробном синтезе целевых лродуктов имеют место индукция, активация, ингибирование, репрессви и некоторые дру-гие регуляториые процессы, усложняющие в целом регуляцию размножения продуцсита и биосинтез им конечного продукта;

8. скорость биосинтеза целевых продуктов более медлеиная по сравнению со скоростями химического синтеза;

9. отдельные виды микроорганизмов, используемых в биотех-нологических процессах, являются болезиетворными и работа с ними должна проводиться с особой тщательностью (дифтерийные и столбнячные палочки, микобактерии туберкулеза, холерный вибрион и др.);

10) некоторыс представители микробного мира должны культивироваться только на (в) живых тканях/клетках (куриные эмбрионы, клетки человека и животных и т. д.); к таким представителям можно отнести вирусы, риккетсии.

Любой биотехнологический процесс реализуют условно в два этапа. Первый из них — предферментация, когда необходимо выполнить все подготовительные работы для реализации второго зтала — ферментации, то есть накопить и выделить целевой продукт.

Предферментация

Это этап включает подготовку питательных сред, биообъекта, воздуха для аэробов и биореактора. Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расхо-дуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количественный составы питательных сред указаны в регламентной документации.

Питательные среды, испольэуемые на подготовительном этапе, могут несколько отличаться от среды, применяемой на втором этапе. Так, например, при пересеве лиофильно высушенной ма-точной культуры обычно рекомендуют обогащенные питательными ингредиентами жидкие среды. Последующие пересевы осуще-ствляют вначале на агаризованную ферментационную среду, а затем — на жидкую.

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды перед их засевом должны быть сгерильными. Биообъект, или промышленный штамм в идеале должен удовлетворять основным требованиям:

1) стабильность структурно–морфологических признаков и физиологической активности при длительных хранении и эксплуатацйи в производстве;

2) повышенные скорости роста и биосинтеза целевого(-ых)продукта(-ов) в лабораторных и проигтодственных условиях;

3. достаточно широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, аэрация, перемешивание, вязхость срсды);

4. умереиная требовательность к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать проиэводственный штамм, тем легче его культивировать и с большей экономической выгодой.

В действительности каждыЙ штамм имеет свои особенности и не по всем показателям отвечает вышелеречисленным требованиям. Как правило, чем богаче усвояемыми ингредиентэми питательная среда, тем лучше растет и метаболизирует на(в) ней микроорганизм. Уже многие годы используют кукурузный экстракт в качестве добавки к питательным средам, поскольку он богат не только источниками углерода и азота, но также микроэлемеитами и витаминами. Сухие вешества в нем составляют 45—55%, в их состав входят зольные вещества —. 1,5—4,5%.

Не менее часто применяют дрожжевой экстракт из клеток Saccharomyces cerevisiae, богатый различными веществами —аминокислотами (аргинином — 5%, валином — 5,5%, гистидином — 4%, изолейцином — 5,5%, лейцином — 7,9%, лизшюм — 8,2%, метионином — 2,5%, тирозином — 5%, треонином — 4,8%, трипто-фаном — 1,2%, фенилаланином — 4,5%, цистином — 1,5%) и витаминами (биотином — 0,06%, инозитом — 0,3%, кальция пантотенатом — 0,01%, кислотой р-аминобензойной — 0,016%, кислотой никотиновой — 0,059%, кислотой фолиевой — 0,001%, пиридоксина монохлоридом — 0,002%, рибофлавином — 0,01%, тиамина монохлоридом - 0,017%, холянхлоридом — 0,27%) в расчете на сухое вещество. К тому же в биомассе клеток дрожжей содер-жится до 50% белков.

Вместо экстракта можно лобавлять автолизат или гидролизат дрожжей.

Объемное и дозирующее оборудование для измерения, транспортировки и загрузки биореакторов аналогично оборудованию, применяемому, например, в пищевой (или вхимической) промыш-ленности: различных типов весы, насосы (например, вакуумные), транспортеры (ленточные, шнековые), элеваторы, контейнеры и др. Газообразные и жидкие продукты обычно подают в биореакторы по системам стерильных трубопроводов. В крупномасштаб-ном производстве питательиыс среды и некоторые их компоненты стерилизуют нагреванием и/или фильтрованием чсрсз пористые мембраны. Тепловая стерилизация может быть периодической и непрерывной; в биотехнологии применяют оба вида стерилизации.

В случае получения лекарствениых средств, например, антибиотиков для парентерального введения, необходима исключительно высокая степень стерильиости питательных сред и целевых про-луктов. При этом необходимо стремиться снизнть, например, вероятность выживания бактериальиых спор до всличииы менее 10^–12, исходя из уравнения:

Понятно, что перед засевом биообъекта стерильными должны быть и питательная среда и биореакторы. Стерилизацию биореакторов часто проводят одновременно со стерилизацией питательной среды в них.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории должна быть подготовлена культура для последующей наработки инокулюма (инокулята), или поссвного материала. В этих целях исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близ-ких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной суш-ки) оживляют прсле добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чисток, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить род-ственные связи), операции по пересеву штамма на среду возраста-ющих объемов (площади) повторяют нссколько раз и проводят в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помещаемым на качалочные устройства (шотгель-аппараты).

Последующую подготовку биооб-ьекта осуществляют в цсхе, используя неболыиие ферментаторы-инокуляторы, в которых наращивают посевной материал ддя промышленных ферментаций. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины — окончания Log-фазы, то есть когда клетки делятся синхронно. Известно понятие степень синхронизации, то есть степень участия клеток популяции в синхронном делении (О.Шербаум, 1959—1960), выражающаяся в индексе синхронизации (Is):

При необходимости синхронизацию деления можно индуцировать, например, метаболическим шоком (предварительный посев культуры на голодные среды), температурным шоком (смена температур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в последующем), или используя одинаковые ио размеру клеткн, механически разделенные, например, фильтрованием (селективные методы) и т. п.

В зависимости от плотности суспензии ее необходимое количество может достигать 1—20% объема производственного ферментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор доставляют очищенный стерильный воздух.

Ферментация

Второй зтап биотехнологического процесса, называемый ферментацией. проводят в производственных биореакторах. По биохимической сущности он во многом имитирует предферментацию и поэтому названный термин является условным. Тем не менее, он принят на практике и в специальной литературе и не нуждается в каких-либо дополнительных пояснениях.

В процессе ферментации также необходимо использование стерильных питательных сред, воздуха и биореакторов, выбор которых обусловлен особенностями культивируемых микроорганизмов.

Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питательная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом — все соединения системы должны бьпъ герметично закрытыми.

Общий объем ферментатора заполняют инокулированной средой на 70—80%, 20—30% объема заполняют газами (инертным — для анаэробов, воздухом — для аэробов).

Аэрация жидкости способствует пенообразованию, снижающему качестяо ферментации, поэтому используют пеногашение либо механическое (установка в верхнеи части ферментатора специальной дополнительной мешалки), либо физико-химическое (использование ПАВ для снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз "газ-жидкость'').

Длительность ферментаций колеблетея в пределах от 4—5 до 14 суток и дольше, что зависит от особенностей физиологической активности биообъектов. Применительво к биосинтезу антибиотиков и экзогликанов периодические ферментации проводят обычно в течение 4—5 суток.