57.Цикл развития каллусных клеток, понятие дифферинцировки и дедифференцировки в основе каллусогенеза. Тотипотентность и ее значение.

Основным типом культивируемой растительной клетки явля-ется каллусная. Значительно реже культивируют клетки опухо-лей растений разного происхождения. Культуры опухолевых клеток при поверхностном и глубинном выращивании мало отли-чаются внешне и на уровне морфологии клеток от культур кал-лусных клеток. Значительным физиологическим различием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяюoая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Опухолевые клетки лишены так-же способности дать начало нормально организованным струк-турам — корням или побегам в процессе органогенеза и эмбрио-идам в процессе соматического эмбриогенеза. В некоторых слу-чаях они образуют тератомы (уродливые органоподобные струк-туры), нормальное развитие которых дальше не происходит.

Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой гормононеза-висимости кодному или обоим гормонам (ауксину и цитокинину), применяемым при выращивании клеточных культур растений, может быть генетической (результат мутации) или эпигенети-ческой (результат экспрессии генов, определяющих гормононе-зависимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя так же, как опухолевые, при эпиге-нетической они теряют признак гормононезависимости в ряду превращений клетка-*-растение-*-клетка, что и является доказа-тельством негенетической природы такой приобретенной гормо-нонезависимости.

Каллусная клетка-,--в результате деления которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточ-ной дифференцировки. Для растения каллус является тканью, возникающей в исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей не-продолжителькое время. Эта ткань защищает место поражения, накапливаег питательные вещества для анатомической регене-рации или (и) регенерации утраченного органа.

Для получения культивируемых каллусных клеток фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду іп vitro в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддер-жание пересадочной культуры требует строго стерильных усло-вий. Для этого с помощью растворов, содержащих активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экс-планты, тщательно отмывая их затем от употребляемого раство-ра стерильной водой. Стерилизуют в автоклаве или фильтрова-нием через ультрафильтры питательную среду. В автоклаве при давлении 19,6 *10⁴ Па (2 атм) в течение I ч или сухим паром в шкафах при 160°С в течение 1,5 ч стерилизуют посуду, инстру-менты, материалы, необходимые для работы. Манипуляции с культурами проводят в боксах микробиологического типа, облу-чаемых перед работой ультрафиолетом, или в ламинар-боксах, где асептика достигается постоянной подачей стерильного воз-духа в рабочий объем (Р. Г. Бутенко, 1964).

Особенности дедифференцировки зависяі_от генетических характеристик тканей. Клетки тканей запасающеи паренхимы, корня и стеб-ля, мезофилла листа и других специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, содержащую мине-ральные соли, источники углерода, витамины и гормоноподобные вещества, должны дедифференцироваться, т. е. потерять структуры, характерные для их специфических функций в растении и вернуться к состоянию делящейся клетки.

При изучении молекулярных механизмов дедифференцировки, действия гормонов и других факторов, индуцирующих деление, небезразлично, в какой фазе клеточного цикла данная клетка перешла к дифференцировке, т. е. с какой фазы ей предстоит двигаться повторно по циклу. Часто эксплант, используемый для получения каллуса, является фрагментом органа и включает ткани, клетки которых различно дифференцированы. Так, взятый целиком фрагмент стебля имеет в своем составе клетки — эпидермальные, первичной коровой паренхимы, камбня и сосудистой системы, сердцевинной паренхимы. В разных условиях культивирования и в зависимости от различий в физиологическом состоянии исходного растения можно наблюдать преимущественную пролиферацию клеток камбия и его молодых дериватов, коры и сердцевинной паренхимы. Различное тканевое происхождение первичных каллусных клеток является одной из причик гетерогенности культуры каллусной ткани, так как некоторые функционалыіые особенности ислодных дифференцированных клеток передаются в ряду клеточных поколений как стойкие модификации или эпигенетически наследуемые признаки.

В клетках экспланта, состоящего из неделящихся, специали-зированных клеток, в самом начале культивирования могут на-блюдаться изменения в метаболизме, вызываемые и травматиче-скими синтезами, и дедифференцировкой, и подготовкой к про-цессу деления. Для разделения этих процессов можно рекомен-довать прединкубацию эксплантов на среде без гормонов в тече-ние 3—6 сут. Это позволяет исключить не только изменения, свя-занные с травмой, но и возможное не контролируемое влияние эндогенных гормонов экспланта на изучаемые процессы. При соблюдении указанного условия становится ясной роль в индук-ции клеточного деления фитогормонов группы ауксинов и цито-кининов, дедифференцировке специализированных клеток и в гюддержании каллусных клеток в делящемся состоянии, приво-дящем к образованию первичного каллуса. При этом наблюда-ются сложные взаимодействия между ауксинами и цитокинина-ми. Присутствие в среде одного ауксина определяет переход специализированной клетки из покоящейся фазы Со к вступлению в S-фазу клеточного цикла. Однако для завершения фазы синтеза ядерной ДНК, синтеза белков, стимулирующих переход клеток к митозу и цитокинезу, необходимо добавление к среде кинетина или другого цитокинина (табл. I).

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех форм РНК (рис. 2), исчезают тканеспецифичные белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и для каллусной ткани. Эти наблюдения свидетельствуют об изменени-ях в активности генов и белкового аппарата клеток при дедиффе-ренцировке.

Очень своеобразно проходит процесс дедифференцировки и каллусогенеза в апикальной меристеме стебля (рис. 3). Сразу после помешения на пита-тельную среду меристемы стебля томатов наблюда лось прекращение мито-зов, свойственных ткани іп vivо клетки дедифференцнровались, увеличивались в объеме, терялн характерную для мери-стематической клетки фор-му, изменялась структура ядра и цитоплазмы и только после этого в них происходило деление, при-водящее к формированию каллусной ткани.

Образование каллуса не во_всехслучаях связ.а-но с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате гіролнферацйи внутреннЮГтканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Примером каллуса, не свя-занного с травмой, является каллусогенез, наблюдающийся в культуре изолированного пыльника. Гашюидная микроспора, проявившаяся в результате мейоза, при культивировании пыль-ника іп vitro отклоняется в ряде случаев от нормального про-цесса микроспорогенеза, ее ядро индуцируется к повторным де-лениям, а сама клетка дедифференцируется и преврашается в каллусную. Образование каллуса при эксплантировании фраг-мента ткани в условиях іп vitro свойственно двудольным и одно-дольным покрытосеменным и голосеменным растенйям, папорот-никам, мхам, печеночникам.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4—6 недель (в зависимости от темпов роста), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется). Размер транспланта (переносимого кусочка) при культивировании на агаризованной питательной среде обычно колеблется от 60 до 100 мг массы тка-ни на 30—40 мл питательной среды.

Резюмируя, можно отметить, что техника культивирования тканей растений позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интакт-ного растения. Клетки различно дифференцированные (в том числе и меристематические) переходят іп vitro к сложному про-цессу дедифференцнации, теряют присущую им структурную орга-низацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус.

В процессе субкультивирования формируется штамм, характе-ризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.