45. Культуры растительных клеток. Методы культивирования. Лекарственные препараты, получаемые из каллусных и суспензионных культур.

В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном состоянии, морфологическая "выравненность", удовлетворительная скорость размножения, сохранность путей метаболизма. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или агломерирующихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в агломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в-некотором приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика—время удвоения их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатноё (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые илитяарлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию воробейника (Lithospermum erythrorbizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем. За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм.