58. Характеристика каллусных и суспензионных культур тканей растений. Понятие физиологической асинхронности и физиологической гетерогенности.

Каллус — неорганизованная, пролиферирующая масса дифференцированных растительных клеток.

Метод культур тканей, или микроразмножение in vitro исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят эксплант; сезона года. Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищен-ные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удале-нием покрывающих структур их каждый раз протирают 70% этанолом. Открытые органы — источники эксплантов подвергают стерилизации ртуть- или хлорсодержащими агентами.

Самая длительная стерилизация по времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно меньше. В усредненном варианте и применительно к различным культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70–95%), рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,01— 0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5; 5—30 и 5—20 минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом. После этого ткань тщательно промывают водопроводной водой в течение 10—30 минут, а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалты-вают в течение отведенного времени. После стерилизации расти-тельный биообъект трижды промывают свежими порциями стерильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими проце-дурами: проведением стерилизации под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того, как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов как твин 80 или твин 20 в виде добавок к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натя-жения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с .материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости (сосуды) для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в сравнении с агаризованной средой, лучше удается освобождать культуры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяющихся в среду, а также предохранять клеточную линию от существенных повреждений при изучении метаболитов, продуцируемых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры могут поддерживаться в течение длительного времени без замены культуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культивирования растительных тканей должны производиться в соответствии с требованиями СМР. Этим гарантируется их высокое качество. Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах. В принципе желательна стерилизация автоклавированием (120⁰С) небольщих объемов питательных сред, поскольку многие ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагрева-нии и давлении. Установлено, что температура выше 120⁰С может быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,22 мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед их использованием. Питателъные среды по своему составу достаточно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны. В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы: источники органического углерода (чаще — сахароза), неоргани-ческие соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти универ-сальной средой для клеток различных видов является среда М5 Т. Мурасиге и Ф. Скуга (см. главу 4). Тем не менее, при работе с разными растительными объектами необходим специальный под-бор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Пи-тательные среды могут быть плотными за счет внесения 0,7—1% агар-агара ижидкими. Показано,например,чтодлямикрокультуры ананасов предпочтителънее жидкие среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из существующих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги, равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они формируются непосредственно в родительской ткани; из промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.