Слияние

Существует два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее время. Первый метод заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1 мл 50%-ного раствора ПЭГ при 37°С с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования.

Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30—35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5—7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой, отмывают и культивируют.

Как отмечалось выше, вместо клеток питающего слоя можно использовать кондиционированную среду. Среду, кондиционированную перитонеальными макрофагами, добавляют к среде культивирования в соотношении 1:1.

Клонирование гибридомных клеток

Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гипоидные клетки.

К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуориметра.

45. Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов и живых гибридных носителей. Технологические схемы производства вакцин и сывороток.

Субъединичные вакцины состоят из фрагментов антигена, способных обеспечить адекватный иммунный ответ. Эти вакцины могут быть представлены как частицами микробов, так и получены в лабораторных условиях с использованием генно-инженерной технологии.

Примерами субъедиинчных вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae и вакцина против менингококка типа А.

Рекомбинантные субъединичные вакцины (например, против гепатита B) получают путем введения части генетического материала вируса гепатита B в клетки пекарских дрожжей. В результате экспрессии вирусного гена происходит наработка антигенного материала, который затем очищается и связывается с адъювантом. В результате получается эффективная и безопасная вакцина.

Вектор, или носитель, - это ослабленные вирусы или бактерии, внутрь которых может быть вставлен генетический материал от другого микроорганизма, являющегося причинно-значимым для развития заболевания, к которому необходимо создание протективного иммунитета. Вирус коровьей оспы используется для создания рекомбинантных векторных вакцин, в частности, против ВИЧ-инфекции. Подобные исследования проводятся с ослабленными бактериями, в частности, сальмонеллами, как носителями частиц вируса гепатита B. В настоящее время широкого применения векторные вакцины не нашли.

54.Области применения моноклональных антител. Характеристика.

Можно использовать моноклональные антитела и в качестве меток для точной идентификации специализированных клеток, например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, позволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность.

Кроме того, можно создавать высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных вирусных штаммов и паразитов. Моноклональные антитела способны также к нейтрализации лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клеткимишени, позволяя избегать серьезных побочных явлений, весьма обычных, например при химиотерапии рака.

Самыми важными областями использования иммунохимического анализа являются:

• контроль банков крови и продуктов из донорской крови;

• обнаружение возбудителей в объектах внешней среды;

• диагностика инфекционных заболеваний;

• диагностика диабета.

Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство иммунодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоятельную область биотехнологической промышленности.