56.Ферменты, используемые в генетической инженерии. Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную плазмиду. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку.

Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа; 1) получение нужного гена; 2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены). Рассмотрим по отдельности каждый этап.

Получение генов. Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) воссозданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы).

Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Помимо этого, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК- Большим успехом в применении метода, основанного на РНК-зависимом синтезе ДНК, является получение в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина),

Введение гена в вектор. Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы — это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы.

Различают два основных класса векторов: вирусы и плазми-ды. Важной проблемой, возникающей при использовании вирусов в качестве генетических векторов, является их аттеньюа-ция — ослабление патогенности для хозяина, чтобы зараженные вирусом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов открывает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом отношении открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем клеткам человеческого тела.

Плазмиды — автономные самореплицирующиеся генетические единицы, найдены у бактерий, грибов, растений и животных. Наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды Е. coii.

Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т. е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Перенос неконъюгативных плазмид путем конъюгации возможен только в том случае, если имеется плазми-да-помощник, способная к самостоятельному транспорту. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т. е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипиче-ского выражения генов.

При конструировании векторов исследователь вводит в него участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам можно отобрать клетки, являющиеся носителями вектора.

Большой интерес представляют космиды — плазмиды, в состав которых введен cos-участок ДНК фага К Е. со//, отвечающий за упаковку ДНК в фаговую частицу. Такие плазмиды способны передавать очень большой объем генетической информации (до 10 тыс. пар азотистых оснований), рекомбинантные ДНК могут быть упакованы в фаговые частицы.

Применительно к генетической инженерии растений перспективны плазмиды бактерий родов Rhizobium и Agrobacterium. Agrobacterium tumifaciens содержит так называемые Ti (tumor-inducing — опухолеродные)-плазмиды, Т-участок ДНК плазмид может встраиваться в геном растений некоторых видов. К числу таких видов растений принадлежат крестоцветные, а также представитель однодольных Asparagus officinalis, что открывает перспективы трансформации злаков с использованием Ti-плазмид (D. von Wettstein, 1984). Ti-плазмиды содержат три гена (онкогены), два из которых кодируют стадии синтеза ауксина, а третий отвечает за синтез цитокинина. Рост нормальных клеток растений регулируется поступлением этих гормонов извне. Клетки, содержащие Т-участок Ti-плазмиды в интегрированном состоянии, размножаются бесконтрольно, образуя наросты — злокачественные опухоли. Плазмиды могут быть «обезоружены» вырезанием у них онкогенов. Вставка в Т-участок гена, кодирующего желаемый продукт, ведет к превращению плазмид в полезный вектор для генетической инженерии. Ti-плазмиды индуцируют в зараженных клетках синтез аномальных аминокислот—производных аргинина: октопина и нопалина, называемых вместе опинами (В. И. Негрук, 1984). Способность к синтезу опинов является полезным генетическим маркером. Agr. rhizo-genes содержит Ri (root-inducing — индуцирующие образование корневых волосков)-плазмиды, которые в клетках растений тоже индуцируют синтез опинов. Как в Т1-, так и в Ri-плазмиды можно встроить длинные нуклеотидные последовательности, что позволяет транспортировать в клетки растений значительные количества генетической информации.

Перенос генов в клетки организма-реципиента. Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, наиболее распространенным способом передачи информации служит трансформация.

Трансформация — это перенос свободной ДНК, в том числе и плазмидной, в. реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходят рекомбинация и интегрирование однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента или какую-либо внехромосомную генетическую единицу. Трансформацию может вызывать ДНК бактерий; впервые это наблюдал Гриффит у пневмококков (1926).

Проникновение ДНК в клетку бактерии требует ее компетентного, т. е. восприимчивого, состояния. У представителей Streptococcus и Pneumococcus выделены и очищены факторы компетентности— белки с молекулярной массой 5—10 мД. Компетентность клетки определяется также условиями внешней среды. У Е. coli и В. subtilis эффективная трансформация достигается обработкой клеток СаСЬ и полиэтиленгликолем (ПЭГ).

Генетический материал, проникающий в клетку, может быть атакован внутриклеточными нуклеазами. В этой связи успешной трансформации способствует: 1) подавление активности или синтеза нуклеаз (трансформация клеток Е. coii с высокой эффективностью была проведена при использовании мутантов, дефектных но нуклеазам) и 2) включение трансформирующей ДНК в липосомы — искусственные мембранные липидные везикулы.

Для проведения трансформации растений и грибов, в частности дрожжей, необходимо получение интактных протопластов. При трансформации протопластов дрожжей с помощью химерных плазмид, сочетавших плазмиду ColEI E. coli и ген LEU2 дрожжей, в присутствии ПЭГ и СаС1₂ клетки приобретали способность синтезировать лейцин. Аналогичным способом получены дрожжи, устойчивые к антибиотику тетрациклину. Ti- и Ri-плазмиды Rhizobium и Agrobacterium трансплантируются в протопласты растительных клеток путем трансформации. Совместное культивирование протопластов растений (петунии) и Agro-bacterium tumifaciens ведет к необычайно высокоэффективной трансформации растительных клеток. Клетки растений могут быть трансформированы генетическим материалом вирусов при включении в фосфатидилсеринхолестериновые липосомы в присутствии ПЭГ и СаС1₂.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Конъюгацию и трансфек-цию можно рассматривать как варианты трансформации, осложненной наличием специальных приспособлений для эффективного переноса генов.

Путем конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). В этом случае информация перекочевывает из одной клетки бактерии (мужской, донорной) в другую клетку (женскую, реципиентную) по половым ворсинкам, представляющим собой белковые трубочки. Хотя круг плазмид, самостоятельно осуществляющих конъюгатнвный перенос, ограничен, неконъюга.тивные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид - помощников.

Под трансфекцией понимают передачу всего набора генов вируса или фага, приводящую к развитию вирусных частиц в клетке. В генетической инженерии методика проведения трансфекции включает в приложении к бактериям получение сферопластов, очистку среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК того или иного фага в сочетании с протаминсульфатом, значительно повышающим эффективность трансфекции. Для стабилизации сферопластов добавляют спермин и другие полиамины (3. Б. Шабарова и др., 1980). Транс-фекция клеток растений и животных соответствующими векторами вирусной природы может быть проведена как при использовании очищенной ДНК и протопластов, так и при заражении целых многоклеточных организмов (в этом случае чаще говорят не о трансфекции, а об инфекции) вирусными частицами или их ДНК. В последние годы сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.