42.Производство ферментных препаратов. Ферменты, используемые как лекарственные средства. Традиционные способы получения ферментных препаратов.

Микрокапсулирование открывает интересные перспективы использования ряда лекарственных веществ, по сравнению с их использованием в виде обычных лекарственных форм.

Применение микрокапсул не ограничивается целью только медикаментозной терапии. Перспективным направлением в области технологии является получение микрокапсул с растворами белков, микрокапсулированных ферментов, антидотов. Исследуется применение микрокапсулированных ферментов – уреазы, уриказы, трипсина. Так, микрокапсулы с уреазой при внутрибрюшинном введении вызывают увеличение концентрации аммиака в крови, после чего мочевина начинает диффундировать из крови во внутрибрюшинную полость и затем в микрокапсулы, подвергаясь новому превращению в аммиак. Микрокапсулирование позволяет также предохранять ферменты от инактивации в результате образования антител-иммуноглобулинов при инъекционном введении.

Включение ферментов в микрокапсулы. Микрокапсулирование ферментов состоит во включении их водных растворов в полупроницаемые мембраны толщиной около 20 нм, непроницаемые для ВМС и клеток, но через которые могут проникать низкомолекулярные вещества. Наличие ультратонкой мембраны позволяет создать высокие концентрации фер-мента в малых объемах раствора, находящегося в микрокапсуле, и сохранять стабильность и биологическую активность инкапсулированных ферментов. Использование фермента в высоких концентрациях, а также большие значения отношения площади поверхности микрокапсул к их объему обеспечивают быструю диффузию низкомолекулярного субстрата из внешней среды к ферменту и продукта реакции из внутреннего объема микрокапсулы в межкапсулярное пространство.

Получены и исследованы микрокапсулированные формы ряда ферментоз, катализирующих различные превращения низкомолекулярных субстратов. Так, микрокапсулированная каталаза, введенная внутривенно или внутрибрюшинно мышам с наследственным нарушением синтеза этого фермента, эффективно снижала содержание перборатов в крови и имела более длительный период жизни в оргаинзме, чем свободный фермент. Микрокапсулированная аспарагиназа, введенная мышам с аспарагинзависимыми опухолями, вызывала стойкое и длительное снижение аспарагина в крови, что препятствовало росту злокачественных новообразований. Микрокапсулированная уреаза после введения крысам в желудочно-кишечный тракт вызывала существенное понижение содержания мочевнны в крови. Следует отметить, что все исследования микрокапсулирозанных ферментов проводятся только на животных. Это связано с тем, что при интракорпоральном их введении материал, используемый для создания мембран, накапливается в основном в селезенке и печени и может быть далеко не безразличен для организма.

Идеальным материалом с точки зрения биологической утилизации микрокапсул в организме человека и животных могут быть различные природные мембраны клеток крови. Фермент при относительно мягких условиях (нейтральная среда, небольшая ионная сила и т. д.) может быть заключен в частично гемолизованные клетки крови (эритроциты, тромбоциты) с последующим восстановлением целостности их мембран. Поскольку размер ферментных элементов крови мал, а время жизни их в кровяном русле относительно велико, такие микрокапсулы могут беспрепятственно и длительно циркулировать в крови. В форменные элементы крови включены такие ферменты, как глюкозидаза, галактозидаза, амилаза, пероксидаза, аргиназа, аспарагиназа и некоторые другие. Все иммобилизованные в клетки крови ферменты имеют неизменяемые каталитические параметры и отличаются большей устойчивостью к повышению температуры.

Применение микрокапсул, содержащих ферменты, экстракорпорально через шунты или камеры имеет хорошую перспективу. Одно из преимуществ состоит в том, что не происходит контакта фермента с иммунокомпетентными клетками, тем самым исключается возможность сенсибилизации организма со всеми неблагоприятными последствиями. Кроме того, применение вне организма исключает накопление в нем искусственных клеток и снимает проблему разрушения и утилизации полимерных материалов. Благодаря ультратонкой полупроницаемой мембране и высоким значениям отношения площади поверхности микрокапсул к их объему, скорость диффузии низкомолекулярных веществ через микрокапсулы выше, чем через диализную мембрану в аппарате "искусственная почка". Принцип энзиматического превращения вредных метаболитов с помощью микрокапсулированных ферментов разрабатывается для применения в аппаратах "искусственная почка" и "искусственная печень". Перспективным может оказаться использова-ние микрокапсулированных ферментов для удаления мочевины — одного из самых токсичных метаболитов клетки. Одним из способов является превращение мочевины под действием микрокапсулированной уреазы в аммоний и углерода диоксид. Вторым — использование экстракорпорального шунта, снабженного микрокапсулами с мультиферментными рециклирующими комплексами.

Большой интерес представляет применение микрокапсул с полиуретановой оболочкой, содержащих водные суспензии антидотов: активированного угля, ионообменных смол и других соединений, характеризующихся способностью к связыванию и инактивации токсических веществ, образующихся и циркулирующих в крови в процессе метаболизма. Очистка крови от указанных веществ осуществляется специальными аппаратами, содержащими сосуды с микрокапсулами, при экстракориаральной циркуляции крови. При этом кровь освобождается также от аммиака. Подобная система может быть эффективно использована при лечении ряда заболеваний почек.

Иммобилизованные ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой рынок сбыта занимают тромболитические ферменты, предназначенные для борьбы с сердечнососудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу — активатор предшественника протеиназы плазмина предотвращающий образование тромба в кровеносной системе.

Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа) используют для борьбы со злокачественным ростом опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин, коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлюлоза, полиамидные волокна, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы — в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов.

Исключительно важны с практической точки зрения работы, посвященные направленному транспорту лекарственных веществ. В этом отношении особенно выгодны инкапсулированные ферменты типа искусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита («тень эритроцита»), а их содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, переносятся кровотоком к зонам скопления аспарагина и поэтому применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частности саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами с ферментом, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата.

Таким образом, использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных отраслях народного хозяйства становится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизованных ферментов способствует созданию новых биотехнологических процессов и методов терапии, совершенствует медицинскую диагностику, анализ, органический синтез и оказывает огромное влияние на образ жизни человека.

43.Биотехнология аминокислот. Преимущества микробиологического синтеза перед другими способами получения. Общие принципы конструирования штаммов микроорганизмов - продуцентов аминокислот как первичных метаболитов.

Аминокислоты — главный строительный материал организма, из которого формируютея пептиды и белки. Растения и микроорганизмы способны сами синтезировать все нужные им аминокислоты из более простых химических соединений. Однако человеческий организм способен синтезировать лишь 12 из 20 аминокислот, необходимых ему для жизнедеятельности. Остальные 8 аминокислот получили название незаменимых и должны поступать в организм извне — с пищей. При нехватке хотя бы одной из незаменимых аминокислот замедляется рост организма, проявляется патология. Поэтому важно синтезировать эти аминокислоты в промышленных масштабах для корректировки рационов питания, в лечебных и профилактических целях и т. д. Кроме того, аминокислоты (как заменимые, так и незаменимые) являются важнейшим сырьем для обеспечения многих биотехно-логических процессов.

Производство многих аминокислот, в том числе и незаменимых, — крупнотоннажиая отрасль химической промышленности. Однако с помощью химических методов получается смесь опти-ческих изомеров аминокислот, иначе говоря, смесь L- и D-аминокислот, молекулы которых в L- и D-форме представляют собой зеркальные изомеры. В химических реакциях эти изомеры практически неразличимы, одиако человеческий организм усваивает лишь L-аминокислоты (за исключением метионина). Для большинства биотехнологических процессов D-аминокислоты также не представляют ценности.

Разделение смеси L- и D-аминокислот, так называемой рацемической смеси, на составляющие их изомеры стало первым процессом в мире, осушествленным с помощью иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Этот процесс был реализован в Японии на предприятии, принадлежащем компании «Танабе Сейяку» в 1969 г. В течение 15 предшествующих лет данный процесс проводился с применением растворимого фермента — аминоацилазы, но он был недостаточно экономичен (I. Chibata, 1976). После перехода на иммобилизованную аминоацилазу экономическая эффективность процесса возросла в полтора раза, и в настоящее время компания осуществляет на промышленном уровне производство пяти L-аминокиелот, из них четыре незаменимые (метионин, валин, фенилаланин, триптофан).

В качестве исходного вещества используются ацилированные D, L-аминокислоты, полученные с помощью обычного химического синтеза. Фермент аминоацилаза гидролизует один ацил-L-изомер, отщепляя от него объемную ацильную группу, и тем самым резко увеличивая растворимость образующейся L-аминокислоты по сравнению с присутствующим в реакционной системе ацил-D-изомером. После этого вещества легко отделяются друг от друга путем известных физико-химических методов. Так выделяется чистая L-аминокислота.

Остающаяся ацил-О-аминокислота при нагревании рацемизуется, т. е. переходит опять в смесь ацилированных D, L-амино-кислот, и процесс повторяют сначала. Таким образом, в итоге единственным продуктом является L-аминокислота. Оказалось, что для аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно лишь строение ацильной части, к кото-рой фермент имеет строгую специфичносгь. В результате этого одна и та же реакционная колонна с иммобилизованной аминоацилазой может быть применена в производстве самых различных L-аминокислот.

Иммобилизованный фермент легко готовить, так как он легко адсорбируется ма специальной смоле, которую затем помещают в реакционную колонну. Время полуииактивации иммобилизованного фермента в промышленных условиях составляет 65 сут. Когда активность катализатора падает ниже нормы, в колонну добавляют раствор свежего фермента (раз в несколько месяцев), который опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя высокая; так, на предприятии японской ком-пании «Танабе Сейяку» он используется более 8 лет в одной и той же колоине без замены (I. Chibata, I978).