Лекции по клинической иммунология и аллергологии_2014

клетки, приводят к утрате сиаловых кислот с ее поверхности, открываются молекулы сахаров, которые связывает МСЛ – запускается лектиновый путь активации комплемента. По «С3а следу» макрофаги легко находят и утилизируют погибшие клетки, покрытые С3b.

Классический путь активации СК. Процесс активации комплемента по классическому пути схож с лектиновым путем, за исключением начальных этапов. Активация СК по классическому пути начинается с формирования молекулы С1 из одной большой субъединицы С1q и двух сериновых протеаз С1r и С1s, присутствующих в растворенном виде во внеклеточной жидкости. Субъединица C1q может связываться с разными лигандами на поверхности бактерий – с липотейхоевыми кислотами на Гр+

бактериях; с C-реактивным белком, который прикрепляется к фосфохолиновым остаткам поверхностных бактериальных молекул, таких как пневмококковый полисахарид, а также с константными фрагментами (Fс-

фрагментами) антител, связанных с антигеном. Наиболее активно связывают

C1q IgM. Быстрый синтез IgM в рамках врожденного иммунного ответа в слизистых оболочках осуществляется особой минорной субпопуляцией В-

лимфоцитов – В1-клетками (см. ниже). Соединение молекул С1q с лигандами активирует присоединение к С1q одной или нескольких пар молекул С1r и

С1s. Образуется комплекс C1qr2s2 (С1-эстераза), обладающий ферментной активностью. С1-эстераза по строению и механизму активации комплемента похожа на комплекс МСЛ с сериновыми протеазами. Поэтому далее процесс

идет аналогично как в лектиновом пути активации комплемента. C1qr2s2

расщепляет С4 компонент комплемента на С4а и С4b. С4b выпадает в осадок и расщепляет С2 на С2а и С2b. С2b остается в растворе, С2а выпадает в осадок и вместе с С4b образует комплекс C4bC2a, обладающий С3-

конвертазной активностью. С3-конвертаза расщепляет С3 компонент комплемента на С3b и С3а.

61

В сыворотке здоровых людей присутствует сывороточный ингибитор С1-эстеразы – С1inh. Он прекращает активацию СК по классическому пути,

так как обладает способностью расщеплять C1qr2s2. Генетически детерминированный дефицит С1inh является причиной заболевания

наследственный ангионевротический отек, при котором вследствие чрезмерного накопления анафилактогенных фрагментов (С4а, С3а)

комплемента развиваются отеки, иногда представляющие угрозу жизни.

Альтернативный путь активации СК. Альтернативный путь обычно включается в процессе активации СК по лектиновому и классическому путям и служит для их усиления, но может запускаться и спонтанно.

Образующиеся в результате активации классического и лектинового пути молекулы С3b плотно связываются с поверхностью бактерии и фиксируют фактор В, находящийся в плазме и тканевой жидкости. В

результате этого конформационные свойства фактора В изменяются и делают его доступным действию фактора D, который расщепляет В на фрагменты Ва и Вb. Вb выпадает в осадок и совместно с фактором С3b

образует нестабильное соединение C3bBb. К C3bBb присоединяется пропердин (фактор Р) – образуется стабильный комплекс C3bBbP,

называющийся С3-конвертазой альтернативного пути и являющийся мощным ферментом, который расщепляет С3 компонент на С3а и С3b. В

результате начинается своего рода цепная реакция: вновь образовавшиеся фрагменты С3b формируют новые молекулы конвертазы, которые вновь включаются в процесс расщепления С3. Создается так называемая «петля усиления синтеза С3b», благодаря которой очень быстро вся поверхность бактерии покрывается молекулами С3b.

Альтернативный путь активации СК может быть запущен в результате спонтанного гидролиза молекул С3. Образующиеся комплексы C3(H2О),

связывают фактор В, который затем расщепляется фактором D на фрагменты

Ва и Вb. Вb соединяясь с C3(H2О) формируют C3(H О)Bb – нестабильную

62

С3-конвертазу, расщепляющую С3 на С3b и С3а. Эти процессы в отличие от лектинового или классического пути идут не на поверхности бактерий, а

непосредственно в тканевой жидкости и образующийся в ходе спонтанной активации С3b очень нестоек и в растворе быстро гидролизуется и инактивируется. Однако если молекулы С3b случайно осядут на поверхности бактерий – это приведет к образованию стабильной С3-конвертазы и запуску петли усиления синтеза С3b. В том случае, когда спонтанно образовавшийся С3b оседает на собственные клетки организма, С3-конвертаза не образуется,

так как на наших клетках имеются особые молекулы, которые, связываясь на клеточной поверхности с С3b, конкурируют с фактором В, а также могут вытеснять Вb из уже сформированных конвертаз. Такими защитными молекулами являются DAF (от англ. Decay-Accelerating Factor – фактор ускоряющийся распад; или CD55), рецептор к комплементу 1 типа (CR1,

также известный как CD35), а также молекулы MCP (от англ. Membrane Cofactor of Proteolysis – мембранный кофактор протеолиза; или CD46).

Молекулы С3b, связанные с CR1, MCP или фактором Н расщепляются и инактивируются фактором I – образуется инактивированный iС3b. Не фиксированные на клеточной мембране, а находящиеся в растворе

конвертазы C3bBb или C3(H О)Bb, также инактивируется под влиянием факторов I и H. Мембраносвязанная конвертаза C3bBb может быть инактивирован фактором H только при наличии на клеточной мембране сиаловых кислот, к которым фактор H имеет сродство. На поверхности бактериальных клеток, а также на поверхности погибших или поврежденных собственных клеток сиаловых кислот нет.

Таким образом, наличие на поверхности собственных клеток сиаловых кислот, молекул DAF, CR1, MCP и др. предотвращает спонтанную активацию комплемента по альтернативному пути на нормальных клетках организма, но не препятствует ее реализации при бактериальной агрессии или на поврежденных собственных клетках.

63

Формирование мембраноатакующего комплекса. С3-конвертазы

альтернативного (C3bBb), классического и лектинового путей (С4b2a)

способны присоединять фрагмент С3b, в результате чего формируются С5-

конвертазы классического/лектинового путей С4b2a3b и альтернативного пути (C3b) Bb, расщепляющие фактор С5 на более крупный нерастворимый С5b фрагмент и мелкий растворимый С5а. Первый из перечисленных связывается с комплексом компонентов комплемента на клеточной мембране, второй остается в жидкой фазе и реализует свою хемотаксическую активность, сходную с С3а. Расщепление С5 открывает терминальный этап активации СК – формирование мембраноатакующего комплекса (МАК).

Как на мембране, так и в растворе С5b обладает способностью связывать компонент С6 с образованием комплекса С5b6, который в свою очередь быстро связывает компонент С7, а затем – С8. Комплекс С5b678 насквозь пронизывает мембрану, фиксируясь на ней. Последний этап формирования МАК состоит в присоединении 12-20 молекул комплемента С9 к комплексу С5b678. Компонент комплемента С9 представляет собой белок,

гомологичный перфорину. Как и перфорин он способен полимеризоваться при контакте с фосфолипидами мембраны. В результате из молекул С9

формируется цилиндрический комплекс, который встраивается в мембрану и образует пору. Массовое формирование МАК нарушает целостность клеточной стенки, в результате чего клетка погибает.

Клетки человека экспрессируют защитный белок – протектин (CD59),

который ингибирует присоединение C9 к комплексу C5b678 и тем самым предотвращает разрушение клеток организма вследствие спонтанной активации комплемента на стадии формирования МАК.

Связывание образующихся в большом количестве молекул С3b (значительно в меньшей степени С4b) с поверхностью бактерий называется

опсонизацией бактериальной клетки и является важной функцией комплемента. Благодаря опсонизации значительно облегчается этап адгезии

64

– прилипания бактерии к фагоциту. Это обусловлено тем, что фагоцитирующие клетки имеют на своей поверхности огромное количество рецепторов к компонентам комплемента (CR), и поэтому могут неспецифически связывать любой патоген, опсонизированный комплементом. Известно, что процесс формирования фагосомы инициируется только в том случае, если не менее чем тысяча рецепторов на поверхности фагоцита свяжутся с соответствующими лигандами

(поверхностными антигенами) фагоцитируемого объекта. Учитывая колоссальное антигенное разнообразие окружающей нас микрофлоры и присущую ей изменчивость, очевидно, что фагоцит не может экспрессировать по 1000 рецепторов, специфичных для каждого варианта патогенов. Поэтому наличие на фагоцитах рецепторов к компонентам комплемента значительно облегчает переход к следующей стадии фагоцитоза. Сигналы, поступающие от этих рецепторов, активируют цитоскелет фагоцита, в результате чего актиновые нити втягивают внутрь клетки мембрану с прилипшим объектом – формируется фагосома.

Компоненты комплемента С3а, С4а и С5а являются активными сосудорасширяющими факторами. При значительном их образовании может развиться циркуляторный коллапс, как при анафилактическом шоке, поэтому их еще называют анафилатоксины. Наиболее активным из них является С5a,

наименее – С4a. Действие этих молекул на клетку реализуется через рецептор связанный с G-протеином. С3a, С4a и С5a расширяют артериолы, а

также повышают проницаемость сосудов – жидкость начинает выходить из артериол, расположенных в зоне бактериальной агрессии. Кроме этого,

молекулы С3a, С4a и С5a стимулируют экспрессию молекул адгезии на эндотелии сосудов, в результате происходит усиление миграции клеток из просвета сосудов в ткани к месту инфицирования. С5а усиливает экспрессию рецепторов к комплементу CR1 и CR3 на моноцитах и макрофагах, что повышает фагоцитарную активность этих клеток. Связывание молекулы С5а

со своими рецепторами на фагоцитах является необходимым условием для

65

активации фагоцитоза. Молекулы С3a и С5a также действуют на тучные клетки подслизистого слоя, стимулируя выброс ими гистамина и ФНО-α,

которые способствуют развитию воспаления. Таким образом, одна из важнейших функций СК – запуск и поддержание местной воспалительной реакции.

Система комплемента играет очень большую роль в реализации противоинфекционной защиты. Доказывает это наличие ряда иммунодефицитных заболеваний, обусловленных врожденными дефектами СК. Дефицит ранних компонентов лектинового и классического путей активации СК (С1-С4, МСЛ), проявляется снижением устойчивости к любым бактериальным инфекциям и увеличением вероятности аутоиммунных,

особенно системных иммунокомплексных заболеваний. При дефектах ранних белков альтернативного пути активации СК снижается устойчивость к гноеродным, преимущественно к грамотрицательным бактериям. При генетических дефектах, приводящих к нарушению продукции или структуры белков поздних компонентов комплемента (С5-С9) повышается риск заболеваний только одним видом инфекции – нейссериями. Устойчивость ко всем остальным инфекциям при этом не нарушается.

Паттерн распознающие рецепторы

Важнейшую роль в реализации механизмов врожденного иммунитета играют паттерн распознающие рецепторы или PRRs (от англ. Pattern Recognition Receptors). Эти рецепторы распознают молекулы, называемые

PAMP (от англ. Pathogen-Associated Molecular Patterns), которые, как правило, отсутствуют в организме-хозяине, но характерны для разных патогенов (вирусов, бактерий, грибов, простейших, паразитов) и, как бы ассоциированы с патогенностью.

Выделяют 4 группы паттерн распознающих рецепторов в зависимости от их расположения в клетке и их функций:

свободные сывороточные рецепторы,

66

связанные с мембраной фагоцитарные рецепторы,

связанные с мембраной сигнальные рецепторы,

цитоплазматические сигнальные рецепторы.

Свободные сывороточные рецепторы. К этой группе относят,

например, маннозо-связывающий протеин. Механизм его действия изложен при описании лектинового пути активации комплемента.

Связанные с мембраной фагоцитарные PRRs. Рецепторы этой группы экспрессируют фагоцитирующие клетки. Распознавание рецептором лиганда на поверхности микроорганизма стимулирует, главным образом,

непосредственно фагоцитарную активность. Связанные с помощью этих рецепторов патогены интернируются и разрушаются в фаголизосоме.

Рецептор к маннозе MR (от англ. Mannose Receptor) – экспрессируется макрофагами и дендритными клетками. Распознает неприкрытые сиаловыми кислотами остатки маннозы на поверхности грибов, бактерий и вирусов.

Дектин-1 – экспрессируется макрофагами, нейтрофилами и дендритными клетками. Распознает и связывает β-1,3-связанные глюканы

(полимеры глюкозы), имеющиеся на поверхности многих микроорганизмов.

Рецепторы к компонентам комплемента (CRs), в частности CR1 –

связывает С3b компоненты комплемента, опсонизирующие микроорганизмы, CR3 – связывает β-глюканы различных бактерий.

Рецепторы мусорщики класса А или SR-A I, SR-A II (от англ. Scavenger Receptors A) и макрофагальные рецепторы с коллагеновой структурой

MARCO (от англ. Macrophage Receptor with a Collagenous Structure) –

связывают различные компоненты бактериальной клеточной стенки и активируют образование фагосомы. Рецепторы мусорщики класса B (SR B) –

связывают и помогают интернировать липопротеины высокой плотности.

Связанные с мембраной сигнальные рецепторы. Связанные с мембраной сигнальные PRRs стимулируют движение фагоцитов, процесс фагоцитоза и выработку фагоцитировавшими клетками активных веществ.

67

Среди них выделяют две основные группы: G-протеин связанные рецепторы и Toll-like рецепторы.

G-протеин связанные рецепторы получили свое название за то, что после соединения с лигандом становятся способными активировать особые внутриклеточные сигнальные G-белки, которые, в свою очередь, активируют различные антимикробные механизмы в фагоцитирующих клетках (таблица

3) и в частности стимулируют выработку ферментов (NADPH-оксидазы,

аденилатциклазу, фосфолипазу, супероксиддисмутазу и др.). В результате активации NADPH-оксидаз, возрастает потребление кислорода клеткой и синтезируется супероксиданион (О2-), а затем и другие активные формы кислорода (перекись водорода Н2О2, синглетный кислород О2 и др.),

свободные радикалы (гидроксил-радикал, галогенсодержащие продукты).

Процесс образования активных форм кислорода и свободных радикалов,

обладающих высокой антимикробной активностью, называется

«кислородный взрыв». Он развивается в течение нескольких секунд, что определяет его название – взрыв. В нейтрофилах этот процесс протекает гораздо более интенсивно, чем при активации макрофагов. Вещества,

образующиеся в результате кислородного взрыва, не только потенцируют активность лизосомальных ферментов, но и сами обладают токсическим действием и вызывают разрушение бактерий в фаголизосоме. К группе G-

протеин связанных рецепторов относятся рецепторы к fMLP, С5а и С3а

компонентам комплемента, хемокиновые рецепторы.

fMLP (fMet-Leu-Phe) – рецептор, распознающий последовательность формилметионин-лейцин-фенилаланин бактериальных полипептидов.

Сигнал от этих рецепторов приводит к усилению продукции бактерицидных веществ в фаголизосомах.

Рецепторы к С5а и С3а – равномерно располагаются на всей поверхности фагоцитов (прежде всего нейтрофилов и макрофагов) и

помогают им найти место, где произошло инфицирование, а также

усиливают антимикробную активность этих клеток. В результате активации

68

комплемента вокруг бактерии образуется облако из растворимых фрагментов комплемента С3а и С5а – концентрация этих молекул уменьшается пропорционально увеличению расстояния от бактерии. За счет этого,

количество занятых рецепторов на ближней к бактерии поверхности фагоцита будет выше, чем на его противоположной стороне. Создается своего рода разность потенциалов и клетка устремляется в ту сторону, на которой с молекулами С3а и С5а провзаимодействовало большее количество рецепторов. Фагоцит будет двигаться в сторону самой высокой концентрации С3а и С5а, то есть к бактерии, на поверхности которой эти молекулы образуются. Направленное движение нейтрофилов и макрофагов по градиенту концентрации молекул С3а и С5а в сторону бактерии называется

хемоаттракция, а эти вещества – хемоаттрактантами.

Таблица 3 – Антимикробные механизмы фагоцитов, активируемые G- протеин связанными рецепторами

Механизмы	Макрофаги		Нейтрофилы
Закисление		pH 3,5-4,0
	Супероксид анион (О2-), перекись водорода (H2О2),
Продукты кислорода	синглетный кислород (О2 ), гидроксил радикал ( OH),
	гипохлорит (OCl-) и др.
Другие токсины		Оксид азота (NO)
Антимикробные пептиды	Кателицидины		α- и β-дефензины,
(первичные гранулы)			кателицидины, лактоферрин
Лизосомальные	Лизоцим, кислые гидролазы (эластаза и другие
ферменты	протеазы)
			Лактоферрин (конкурирует с
Конкуренция			бактериями за Fe)
			В12-связывающий протеин

Хемокиновые рецепторы. Позволяют клеткам иммунной системы осуществить хоминг, выйти из сосуда и найти место, где развивается воспаление. Нейтрофилы, например, в отличие от макрофагов, не являются резидентными тканевыми клетками, они должны выйти из системного

69

кровотока и попасть в место инфицирования. Здесь, благодаря ряду факторов

(хемокины, комплемент и PRRs рецепторы), нейтрофил обнаруживает объект для фагоцитоза, «приклеивается» к нему и втягивает объект внутрь.

Формируется фагосома, которая сливается с первичными и вторичными гранулами нейтрофилов, содержащими антимикробные пептиды и другие активные вещества, а также с лизосомами, содержащими ферменты,

необходимые для уничтожения бактерии.

Toll-like рецепторы (TLRs, от англ. Toll-Like Receptors) участвуют в реализации эволюционно очень древнего защитного механизма. Впервые

Toll-рецепторы были обнаружены у Drosophila melanogaster. У

млекопитающих рецепторы, схожие с Toll-рецепторами дрозофилы, так и назвали – Toll-like receptors, что в переводе с английского значит «рецепторы,

похожие на Toll-рецепторы». У человека описано 10 TLRs, 5 из которых

располагаются внутриклеточно и 5 – на наружной поверхности клетки.

Внеклеточные TLRs распознают наиболее общие для разных видов

микроорганизмов (преимущественно бактерий) молекулярные паттерны

(таблица 4).

Представленные рецепторы, за исключением TLR-5, работают в паре.

Например, TLR-1 в паре с TLR-2, TLR-2 с TLR-6. При появлении антигена,

на который они могут реагировать происходит полимеризация парных рецепторов и образуется гетеродимерная молекула, в которой две разные молекулы связаны между собой: TLR-1:TLR-2 или TLR-2:TLR-6. Рецептор

TLR-4 тоже работает в паре, но с молекулой MD-2 и CD14. Молекула CD14

имеется на поверхности нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток и функционирует самостоятельно как фагоцитарный рецептор, который связывает липополисахариды. Но на макрофагах и дендритных клетках CD14

выполняет также роль дополнительной молекулы для TLR-4, что необходимо для реализации функции этого TLR рецептора.

Внутриклеточные TLRs распознают преимущественно продукты вирусного происхождения (таблица 5). Эти рецепторы способны

70