Прямые методы подсчета соматических клеток

К ним относят метод подсчета на стекле по Прэскотту-Бриду, камерные методы по Н.М.Хилькевичу, И.И.Архангельскому и др. в модификации В.И.Слободяника, подсчет с помощью электронного прибора «Фоссоматик», электронных счетчиков частиц: целлоскоп, «Культер-Каунтер», пикоскель, гемоцитометр кондуктометрический марки ГЦМК-3 и др.

Метод Прэскотта-Брида. Чистое предметное стекло кла­дут на лист бумаги, расчерченный на квадраты со стороной 1см. Пробу молока тщательно перемешивают и с помощью микропипетки на­носят на 3-4квадрата предметного отекла по 0,01см³. Нанесенную каплю молока равномерно распределяют по площади квадрата стеклян­ной палочкой или препаровальной иглой. Мазок высушивают на возду­хе, фиксируют и одновременно обезжиривают нанесением сначала ме­тилового спирта на 10-15мин, а затем спирт-эфирной смеси до высыхания. Окрашивают мазок рабочим раствором краски Романовского-Гимза (3-4мл продажного раствора на 100мл дистиллированной во­ды) методом подслаивания иди при вертикальном положении стекла в течение 20-30мин. После окрашивания мазок промывают водой и вы­сушивают при комнатной температуре.

Подсчет соматических клеток ведут под микроскопом с иммерси­онным объективом. В каждом мазке просматривают 100полей зрения. Подсчитанное число клеток умножают на коэффициент с учетом значе­ний объектива и окуляра и определяют их количество в 1см³моло­ка. Для выведения коэффициента с помощью объект-метра определяют диаметр поля зрения микроскопа и вычисляют площадь одного поля зрения по формуле πR². Затем вычисляют, сколько полей зрения мик­роскопа размещаются на площади 1см². Полученный результат пере­водят на объем.

Пример: определение коэффициента пересчета при окуляре 7 и объективе 90.В поле зрения размещается 17делений объект-метра. Величина одного деления - 0,01мм. Диаметр поля зрения - 0,01мм х 17 = 0,17 мм,радиус - 0,085мм. Площадь одного поля зрения -3,14 x 0,085² = 0,023мм²или 0,00023см². Площадь 100полей зре­ния будет равна 0,00023см²х 100 = 0,023ом². На площади 1см² таких участков будет: 1 : 0,023 = 43,48.Взятый объем молока 0,01 см³в 100раз меньше 1см³. Коэффициент в данном случае будет ра­вен 4348 (43,48х100).

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Метод Н.М.Хилькевича.В пробирку наливают 0,4мл разведенной краски Романовского-Гимза. (1мл дистиллированной воды и 5 капель краски) и 20мм³исследуемого секрета вымени, получают разведение1:20.Через 15-30мин заполняют камеру Горяева. Лейкоциты подсчи­тывают в 1большом квадрате и результат умножают на 5000.

Метод И.И.Архангельского и др.Сначала готовят солюбилизирующий раствор по следующей прописи. К 0,9%раствору натрия хлорида, содержащего 1%формалина и 12,5% этилового спирта, до­бавляют 1%солюбилизатора и нагревают при 60°С в течение 20мин. В качестве солюбилизатора используют синтанол ДС-10 (оксиэтилированные жирные спирты фракции С₁₀-С₁₆с 10молями окиси этилена) или ПП-40 (полиоксиэтилированное производное пентола с 40молями окиси этилена).После растворения солюбилизатора к раствору до­бавляют I%насыщенного спиртового раствора основного фуксина и фильтруют через бумажный фильтр. Краску к солюбилизирующему раст­вору добавляют непосредственно перед опытом.

Для подсчета соматических клеток в пробирку, содержащую 10 мл солюбилизирующего раствора с красителем, добавляют 0,1 мл тща­тельно перемешанного молока и прогревают в водяной бане при 80°С 30мин. После остывания содержимое пробирки перемешивают и вносят каплю жидкости под покровное стекло счетной камеры :Горяева, Фукс-Розенталя или др. Подсчет клеток ведут под микроскопом (оку­ляр 7или 10,объектив 8или 10)во всей камере или в определен­ном ее объеме.

Расчет количества соматических клеток в 1см³проводят по формуле:

1000 х С х А

Х= --------------------------,

V

где Х -количество соматических клеток в 1см³молока;

А -количество подсчитанных соматических клеток;

С -разведение;

1000 -множитель, приводящий результат к объему 1см³;

V -объем, в котором подсчитаны клетки.

Метод И.И.Архангельского и др. в модификации В.И. Слободяника.Модификация метода И.И. Архангельского и др. заклю­чается в том, что насыщенный спиртовой раствор основного фуксина добавляют к солюбилизирующему раствору в количестве не I%,а0,25%.и используют готовый красящий раствор в количестве не 10 мл, а 5.

Это позволяет готовить полностью красящий раствор заблагов­ременно и использовать его в течение 15дней после приготовления.

Расчеты ведут по вышеизложенной формуле с учетом сделанного разведения пробы молока.

Подсчет на приборе «Фоссоматик». Принцип работы прибора основан на том, что ядра соматических клеток молока окраши­вают флюорохромовыми красителями и равномерно распределяют обра­зец на вращающемся барабане. С помощью электронного устройства учитывается количество флюоресцирующих точек и полученный резуль­тат с помощью самописца фиксируется на ленте.

Производительность работы прибора составляет 180проб молока в1ч.

Подсчет на электронных счетчиках частиц: целлоскопе «Культер-Каунтере», пикоскеле, гемоцитометре кондуктометрическом марки ГЦМК-3 и др.Принцип действия этих приборов основан на из­менении электрического сопротивления частиц, подлежащих подсчету. При прохождении соматических клеток через капиллярное отверстие скачкообразно повышается сопротивление, это служит импульсом, ко­торый регистрируется и подсчитывается электронным путем. Счетчики снабжены дискриминатором -устройством, которым подсчитывают только частицы определенной величины.