Определение бактериальной обсемененности молока редуктазным методом

Метод основан на восстановлении метиленового голубого окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко мик­роорганизмами. По продолжительности обесцвечивания метиленового голубого оценивают бактериальную обсемененность молока.

1)Приготовление основного спиртового раствора метиленового голубого.

10г метиленового голубого смешивают со 100мл 96% раствора этилового спирта, ставят в термостат при температуре 37°С на 24ч, фильтруют в термостате при той же температуре.

Приготовление рабочего раствора метиленового голубого.

Основной раствор помещают в водяную баню при температуре 45°С на 5-10мин, перемешивают до полного растворения кристаллов. Затем быстро охлаждают до температуры 20°С и 5мл этого раствора прибавляют к 195мл дистиллированной кипяченой воды. Смесь хорошо перемешивают. Хранят рабочий раствор при температуре 8-10°С не более 7суток.

В пробирку наливают 1мл рабочего раствора метиленового голубого и 20мл исследуемого молока, закрывают стерильной резино­вой пробкой и смешивают путем медленного переворачивания пробир­ки. Пробирку помещают в редуктазник с температурой воды 37°С, или водяную баню, или термостат. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру воды 37°С поддерживают в течение всего времени определения. Момент погруже­ния пробирок в редуктазник считают началом анализа

Наблюдение за изменением окраски проводят через 20мин, 2ч и 5ч 30мин. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока. При этом оставшийся кольцеобразный окрашенный сдой вверху и внизу шириной не более 1см в расчет не принимается. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко от­носят к одному из четырех классов по бактериальной обсемененности.

Таблица. 3.

Бактериальная обсемененность молока, определенная редуктазным методом с метиленовым голубым

Классласс	Качество молока	Продолжительность	Количество бактерий
		обесцвечивания	в 1мл молока
1 Хорошее		Более 5ч 30мин До 500тыс.
2	Удовлетворительное	Более 2ч до5ч 30мин	От 500тыс.до4млн.
3	Плохое	Более20 мин до 2 ч 20мин и менее	От 4до 20млн. От 20млн. и более
4 Очень плохое

Определение ингибирующих веществ в молоке

Ингибирующими веществами, попадающими в молоко, чаще всего могут быть антимикробные и дезинфицирующие средства. Первые выде­ляются молочной железой при различных способах применения больным.животным, в том числе и при интрацистернальном введении. Вторые попадают в сборное молоко в результате недостаточного отмывания проточной водой доильного оборудования и молочной посуды.

а) С индикатором резазурином.

Метод основан на восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительного к ингибирующим веществам микроба видаStгерtососсusthermophilus.

Приготовдение коллекционной тест-культуры:

В пробирку с 10мл стерильного обезжиренного молока вносят одну петлю культурыStгерtососсusthermophilusи выдерживают в термостате при температуре 42-43°С в течение 16-18ч. Коллекцион­ную тест-культуру хранят при температуре 6-8°С и перевивают через10-14суток.

Приготовление рабочей тест-культуры:

В пробирку с 10мл или баночку со 100мл обезжиренного моло­ка вносят соответственно 1петлю или Iмл коллекционной тест-культуры и выдерживают в термостате при температуре 42-43°С в течение 16-18ч.

Проведение анализа:

Для анализа используют 1-2-суточную рабочую тест-культуру при условии хранения ее в холодильнике при температуре 6-8°С.

В чистые пробирки наливают по 10мл исследуемого молока и закрывают стерильными резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы молока сохраняют в холодильнике при температуре 6-8°С. Одновре­менно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают10мл молока, свободного от ингибирующих веществ. Это молоко мож­но хранить в холодильнике при температуре 6-8°С не более суток. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до 85-90°С, выдерживают 10мин. затем охлаждают до 43-45°С. После этого в пробирки стерильной пипеткой вносят по0,3мл рабочей тест-культуры. Содержимое пробирок тщательно пере­мешивают путем трехкратного переворачивания и выдерживают при температуре 42-43°С в редуктазнике или водяной бане в течение 2 ч. После этого во все пробирки вносят по 1мл 0,05% раствора резазурина с температурой не ниже 18-20°С. Содержимое пробирок тща­тельно перемешивают. Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдерживают в редуктазнике или водяной бане при температу­ре 42-43°С в течение 15 мин.

Учет результатов:

При отсутствии в молоке ингибирующих веществ (и в контроль­ной пробе) содержимое,пробирок будет иметь розовый или белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое проби­рок будет иметь сине-стальную, сине-фиолетовую иди фиолетовую, окраску.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина более 0,01МЕ/мл, формалина около 0,005%, пере­киси водорода, более 0,01%

б) С индикатором метиленовым голубым

Метод основан на восстановлении метиленового голубого при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам микро­организмов вида Stгерtососсusthermophilus.

Готовят коллекционную и рабочую тест-культуру.

Приготовление 3% водного раствора пептона. Проводят по ре­цепту 14.

Приготовление 0,5%раствора метиленового голубого. 500мг метиленового голубого помещают в колбу, доливают до 100мл дис­тиллированной кипяченной водой, перемешивают до полного растворе­ния, плотно укупоривают и хранят в холодильнике при температуре 6-8°С не более 30суток.

Приготовление смеси для анализа:

К 20 мл 3% водного раствора пептона добавляют 3,5мл односуточной культуры термофильного стрептококка (пипетку предваритель­но следует хорошо ополоснуть этой смесью) и 0,1мл 0,5% водного раствора метиленового голубого. Смесь хороша перемешивают. Смесь готовят перед анализом.

Проведение анализа:

В чистые пробирки наливают по 10 мл исследуемого молока и закрывают (неплотно) резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы хранят в холодильнике при температуре 6-7°С в течение суток. Про­бирки с молоком нагревают в водяной бане до температуры 85-90°С и выдерживают 10мин, затем охлаждают до 42-45°С. После этого в пробирки вносят стерильной пипеткой по 2мл приготовленной смеси, перемешивают путем трехкратного переворачивания пробирок и выдерживают в водяной бане при температуре 41-42°С в течение1ч 40мин -2ч 20мин.

Учет результатов:

При отсутствии в молоке ингибирующих веществ содержимое про­бирок будет иметь белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое проби­рок будет иметь голубой цвет. Голубое кольцо, образующиеся в про­бирке на поверхности молока высотой 1см, не учитывают.

Чувствительность метода позволяет обнаружить пенициллин от 0,01до 0,1МЕ/мл, стрептомицин от 30-50мкг/мл, тетрациклин, окситетрацикдин -1 МЕ/мл, олеандомицин -10 МЕ/мл, формалин - от 0,003 до 0,005%, перекись водорода от 0,01до 0,1%.