Определение общих иммуноглобулинов

Методом с сульфатом натрия

Подготовка к анализу

1)Приготовление молочной сыворотки.пробу молока (молозива) центрифугируют в течение 30мин при3000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на20-30мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллиро­ванной водой в 5-10раз, подогревают до температуры 37°С и добав­ляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6, для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.

2. Приготовление 18% раствора сульфата натрия.

18г обезвоженного сульфата натрия растворяют в 100мл дис­тиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притертой крышкой.

В пробирку вносят 1,9мл 18% раствора сульфата натрия, до­бавляют 0,1мл испытуемой сыворотки молока (молозива),тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм (синий светофильтр № 3)в кювете с рабочей гранью 5мм относи­тельно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения опти­ческой плотности выше отметок 1,300-1,500сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3раза. Степень разведения учитывают при расчете конечных результатов.

По данным оптической плотности образцов сыворотки молока (молозива) с учетом степени разведения определяют концентрацию иммунных глобулинов по калибровочной таблице:

Таблица.4.

Калибровочная таблица

Оптичес­кая пло­тность	Содержание иммуногл, мг%	Оптичес­кая пло­тность	Содержание иммуногл., мг%	Оптичес­кая пло­тность	Сдержание иммуногл., мг%
0,01 12 0,15 191 0,65 730
0,02280,16 203 0,70 790
0,03 35 0,17214 0,75 840
0,04 46 0,18 225 0,80 890
0,05 57 0,19 236 0,85 950
0.06 69 0,20 247 0,90 1010
0,07 80 0,25 290 0,95 1060
0,08 91 0,30 340 1,05 1170
0,09 103 0,35 400 1,10 1230
0,10 114 0,40 4501,15 1290
0,11 130 0,45 500 1,20 1340

а) Метод радиальной иммунодиффузии

В основу метода положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесе­нии исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.

Подготовка к анализу:

Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к иммуноглобулинам классов А, G,М.

3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1М веронал-мединаловом бу­фере с рН 8,6смешивают нагретым до температуры 56°С в соотноше­нии 1:1с моноспецифической антисывороткой, в которой концентра­ция антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1М веронал-мединаловом бу­фере с рН 8,6.Агар, смешанный с моноспецифической антисыворот­кой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинках раз­мером 9х12см. Для этого на пластинку помещают латунную иди пластмассовую П-образную рамку толщиной 1 мм,сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинками заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9мл.

Приготовление молочной сыворотки:

Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при 2000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 80-30мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10%раствор уксусной кислоты, до­водя рН до 4,6для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифуги­рованием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа:

В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2мкл стандартной не разведенной и разведенной 1:2, 1:4, 1:8, 1:16моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объемом по 2 мкл. Пластинки инкубируют во влажной камере в течение 24ч при температуре 4°С, а пластинки с антисывороткой -к иммуноглобулину М-48ч.

Обработка результатов:

После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципита­ции. По данным разведении стандартных сывороток строят калибро­вочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией иммуноглобулинов и диаметром колец преципитации. Для этого на полуло­гарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат -известное количество иммуноглобулинов (МЕ/мл или мг/мл), содержащиеся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки сое­диняют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.

Для определения уровня иммуноглобулинов в испытуемой молоч­ной сыворотке на оси абсцисс откладывают диаметр кольца преципи­тации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина каждого клас­са, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.

По данным Н.А. Сапожниковой (1992),концентрация иммуногло­булинов классаGв молоке клинически здоровых коров составляет: после родов - 7,9710,31мг/мл, в середине лактации - 1,78+0,09 мг/мл, в период запуска - 8,28+0,38мг/мл, у больных субклиничес­ким маститом - 15,02+0,87,2,56+0,09и 11,87+0,59мг/мл, иммуноглобулинов класса М соответственна 0,3й±0,03, 0,14±0,01, 0,34±0,04 мг/мл и 0,53+0,04, 0,23+0,01и 0,39±0,05 мг/мл.

б) Химический метод по Бадин и Раусселет.

1)Приготовление цинк-салицилового реактива.

1,875сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14г салицилового натрия, доливают водой до 900-950мл. Измеряют рН, доводят 0,1н раствором едкого натра до 7,3,после доводят раствор до 1л в мерной колбе бидистиллированной водой.

2)Приготовление раствора кальция хлорида.

2мл официального 10% раствора кальция хлорида (фиксанола) смешивают с 117мл бидистиллированной воды.

3)Приготовление тимолового реактива.

Сначала готовят 10% раствор тимола на 96°спирте. Затем 1мл спиртового раствора растворяют в 80мл веронал-мединалового буфе­ра, встряхивают и .доводят до 100мл.

4)Приготовление веронал-мединалового буфера.

2,76г веронала растворяют в 1-литровой колбе в небольшом количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06г мединала, после растворения определяют рН и доводят вероналом или мединалом до 7,5,раствор доводят до метки 1л бидистиллированной водой.

5)Приготовление цинкового реактива.

0,28г веронала, 0,21г мединала и 0,024г сульфата цинка растворяют в 1л бидистиллированной воды, доводят до рН 7,5веро­налом или мединалом.

6)Приготовление раствора сернокислого аммония.

189,0г сернокислого аммония и 29,3натрия хлорида растворя­ют в 1л бидистиллированной воды.

7)Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при2000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную иди соляную кис­лоту по каплям, доводя рН до 4,6.Казеин отделяют центрифугирова­нием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр. Доводят рН сы­воротки до 7,2-7,30,1н раствором едкого натра.

8)Построение калибровочных кривых.

Используют эталонные сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов классов А, G, М. К 1мл эталонной сыворотки добавля­ют 1мл физиологического раствора, тщательно перемешивают и 1мл разведении добавляют к 1мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрически при длине волны 400-470нм (синий светофильтр) и строят калибро­вочные кривые зависимости величины оптической плотности от кон­центрации иммуноглобулинов А,G, М.

Проведение анализа:

1)Определение иммуноглобулинаG.

в пробирку № 1вносят 5мл цинк салицилового реактива, до­бавляют 1,1мл молочной сыворотки, выдерживают 1мин и колориметрируют при длине волны 400-470мл (синий светофильтр). В пробирку № 2вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют0,05мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны400-470нм (синий светофильтр).

2)Определение иммуноглобулина М. В пробирку № 3вносят б мл цинкового реактива, добавляют0.05 мл сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470нм (синий светофильтр).

3)Определение иммуноглобулина А.

В пробирку № 4вносят 6мл раствора сернокислого аммония, добавляют 0,05мл молочной сыворотки и колориметрируют при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр

Обработка результатов:

Для каждого класса иммуноглобулинов проводят расчет оптичес­кой плотности исследуемых растворов, а затем по калибровочной кривой с учетом этих данных определяют их количественное содержа­ние.

Иммуноглобулин G.

Д_G = Д₂х 2 + Д₁

где Д_G -оптическая плотность иммуноглобулинаG;

Д₂ -оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке №2;

Д₁ -оптическая плотность раствора молочной сыворотки в про­бирке № 1;

2 –коэффициент.

Иммуноглобулин M

Д_M = Д₃х 2

где Дм -оптическая плотность иммуноглобулина;

Дз -оптическая плотность раствора молочной сыворотки в про­бирке № 3;

2 –коэффициент.

Иммуноглобулин А.

Да= Д₄ х 2

где Да- оптическая плотность иммуноглобулина А;

Д₄ - оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;

2 -коэффициент.