Правила отбора проб молока (секрета)

Молоко (секрет) для бактериологического исследования отбира­ют в стерильные пробирки из долей вымени с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием пробы соски вымени и руки исследователя протирают ватным тампоном, смоченным 70°этиловым или денатурированным спиртом, и надаивают в пробирки 5-10мл альвео­лярного молока (в конце дойки). При взятии пробы следят за тем, чтобы сосок не касался края пробирки. При повторном взятии пробы с целью подтверждения диагноза на мастит может быть использовано как цистернальное, так альвеолярное молоко. Пробирку с молоком (секретом) закрывают стерильной ватно-марлевой или резиновой пробкой и на этикетке записывают кличку или инвентарный номер коровы, долю вымени и ее состояние (здоровая, больная).

Правила доставки

Пробы молока после их отбора с сопроводительным документом доставляют в лабораторию в течение 3-4 ч с момента взятия в спе­циальных емкостях, обеспечивающих температуру не выше 8-10°С, или в термосах со льдом.

Проведение исследований

Бактериологическое исследование молока (секрета) проводят сразу после доставки его в лабораторию. Оставшееся молоко хранят при температуре не выше 6°С.

Посев молока (секрета) проводят на мясо-пептонный агар с цитратной кровью крупного рогатого скота или дефибринированной кровью барана (рецепт 1)и дифференциально-диагностические или элективные среды.

Для идентификации выросших культур микроорганизмов учитывают характер роста колоний и вид гемолиза на кровяном МПА, проводят микроскопию мазков, сделанных из одинаковых по морфологическим свойствам колоний и окрашенных по Грамму, изучают культурально-би­охимические свойства.

а) Выделение золотистого стафилококка

Рост на кровяном МПА. Колонии средние и крупные, выпуклые с гладкой или шероховатой поверхностью, ровными краями, золотистого цвета.

Образуют зону гемолиза.

α-гемолиз -зона прозрачная вокруг колонии; β-гемолиз -зона непрозрачная (матовая.),лучше проявля­ется при выдержке посевов в холодильнике при температуре 5-8°С в течение 24ч; α и β гемолиз смешанный.

При микроскопии имеют шарообразную форму и располагаются в виде гроздевидных скоплений, тетрами или одиночно. По Грамму кра­сятся положительно.

ДНК-азная активность. Выделение золотистого стафилококка ус­коренным методом и определение ДНК-азной активности проводят с использованием элективной, дифференциально-диагностической среды ДНК-новокаинового агара (рецепт 2).

Элективные свойства среды обусловлены ингибирующим действием на постороннюю микрофлору новокаина, дифференцирующие -наличием ДНК, позволяющей идентифицировать золотистый стафилококк по его дезоксирибонуклеазной активности.

Готовят разведение исследуемых проб молока, (секрета) на сте­рильном физиологическом растворе 1:10и 1:100.В чашку Петри с ДНК-новокаиновым агаром вносят 0,1мл молока (секрета) в разведе­нии 1:100и равномерно распределяют стерильным стеклянным шпате­лем по всей поверхности питательной среды. Засеянные чашки поме­щают в термостат крышками вниз и инкубируют при 37-38°С в течение22-24ч. Для выделения ДНК-азной активности золотистого стафило­кокка поверхность среды в чашках с выросшими культурами заливают5-7мл 1н раствора соляной кислоты. Чашки с кислотой выдерживают2-3мин, затем кислоту сливают и учитывают результаты, просматри­вая чашки в проходящем свете.

При выделении культуры стафилококка на кровяном агаре и на­личии изолированной чистой культуры ДНК-азная активность может быть определена путем посева на ДНК-агар (рецепт 3).

На ДНК-новокаиновом агаре золотистый, стафилококк растет в виде крупных круглых колоний с ровными краями, окруженных зоной просветления с четкими границами.

Для определения количества золотистого стафилококка в 1мл исследуемого молока (секрета) подсчитывают колонии с зоной прос­ветления по всей поверхности среды и полученное число колоний ум­ножают на 10(брали 0,1мл материала) и на 100(степень разведения).

Каталазная активность. На предметное стекло наносят каплю 10% перекиси водорода и в ней растирают внесенную бактериологи­ческой петлей чистую культуру микроорганизмов.

При положительной реакции на каталазу происходит интенсивное газообразование которое проявляется вспениванием капли перекиси водорода. Фермент каталазу содержат стафилококки и микрококки.

Реакция плазмокоагуляции (РПК).Культуру стафилококка высе­вают в пробирки с мясо-пептонным бульоном и через 3ч после выращивания в термостате при температуре 37°С используют для поста­новки РПК с цельной или сухой плазмой крови кролика. Для этого плазму разводят стерильным физиологическим раствором в соотноше­нии 1:5и разливают в аглютинационные пробирки по 0,5мл. Бульонную культуру стафилококка по 0,1мл (2капли) вносят в пробирки с разведенной кроличьей плазмой. Для контроля в одну пробирку с плазмой не вносят культуру, а в другую засевают заведомо плазмо-аглютинирующий стафилококк. Пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и через каждый час в течение 3ч, 18и 24ч учитывают результаты.

При положительной реакции РПК образуется сгусток, который не выпадает из пробирки при наклоне или плавает в плазме.

Золотистый стафилококк является плазмокоагулируюшим.

Ферментация манита в анаэробных условиях.Суточную бульонную культуру стафилококка в количестве 0,2мл(3-4капли) высевают в пробирку с 0,15% полужидким агаром, содержащим 0,15%манита и индикатор Андраде, под вазелиновым маслом (рецепт 4).Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С. Результаты учитывают через каждые 24 ч, а окончательный результат -через 5сут.

Появление розового окрашивания (изменение цвета индикатора) указывает на ферментацию манита в анаэробных условиях, что является дифференцирующим признаком для золотистого стафилококка.

б) Выделение стрептококков

Рост на 5% кровяном МПА.Колонии мелкие, росинчатые, образу­ют зону гемолиза α и β, смешанную или она отсутствует.

При микроскопии имеют шарообразную, бобовидную форму и рас­полагаются в виде коротких или длинных цепочек.

Рост на среде Карташовой (рецепт 5).В пробирку со средой вносят 1мл исследуемого молока или пересевают выросшие на кровя­ном агаре росинчатые колонии и инкубируют в термостате при темпе­ратуре 37°С в течение 18-24ч.

Из пробирок с измененным цветом среды делают мазки,окраши­вают по Грамму и проводят микроскопию на предмет обнаружения стрептококков.

Каталазная активность.Проводится аналогично как для стафилококков.

Стрептококки не содержат фермент каталазу, поэтому с пере­кисью водорода дают каталазоотрицательную реакцию.

Устойчивость к желчи.Предварительно культуру стрептококков выращивают в мясо-пептонном бульоне (МПБ) с I%глюкозы (рецепт6),а затем вносят 1мл культуры в пробирки с 5мл МПБ, содержа­щего 40% желчи (рецепт 7)и ставят в термостат при температуре 37°С на 24ч.

Полное просветление бульона указывает на лизис культуры, по­мутнение -на рост.

Рост в МПБ с рН 9,б. 1млбульонной культуры стрептококков, выращенных на МПБ с глюкозой (рецепт 6),вносят в пробирку с 5мл МПБ и рН 9,6,инкубируют в термостате при температуре 37°С в те­чение 24ч.

Обесцвечивание среды указывает на наличие роста стрептокок­ков, восстанавливающих своими окислительно-восстановительными ферментами метиленовый синий.

Этим свойствам обладают стрептококки серологических групп Dи N.(по Ленсфильд).

КАМП-тест.Основан на том, что стрептококки групп В при вы­ращивании на кровяном агаре, содержащем стафилококковый β-токсин, образуют дополнительную, ясно выраженную зону гемолиза эритроци­тов барана, крупного рогатого скота.

Суточную бульонную культуру β-гемолитического стафилококка высевают на 5%кровяной агар сплошной линией по диаметру чашки Петри. Перпендикулярно к линии посева стафилококка, не доходя 5-6 мм,высевают ровным штрихом испытуемую культуру стрептококков. На одной чашке можно проверить 8-10культур.

КАМП-тест считают положительным, если четко выражена зона гемолиза испытуемого стрептококка в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне β-гемолитического стафилококка. Наиболее ярко эта зона проявляется после выдержки чашек в холодильнике в те­чение 18-84.

в) Выделение бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Образцы молока или колоний с кровяного агара, морфологичес­кие свойства которых напоминают БРКП, высевают на среду КОДа (ре­цепт 9)и помешают в термостат при температуре 35°С на 24ч.

Изменение цвета среды из фиолетового в зеленый свидетельст­вует о наличии ВГКП.

Идентификацию эшерихий, бактерий рода энтеробактер от сальмонелл и протея проводят на среде Олькеницкого (рецепт 10).Со среды КОДазеленого цвета посев на среду Олькеницкого в пробирках проводят бактериологической петлей на поверхность скоса среды и внутрь столбика. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24ч.

Изменение цвета (глюкоза+, лактоза+) скоса и столбика среды из красного в желтый при отсутствии почернения внутри свидетель­ствует о росте бактерий группы эшерихий.

Изменение скоса среды и столбика в малиновый цвет (мочевина+) и почернение внутри столбика (сероводород+) указывает на рост протея.

Изменение скоса в красный, столбика в желтый и почернение внутри столбика указывает на рост сальмонелл.

г) Выделение синегнойной палочки.

Бактерии этой группы при росте на питательных средах выраба­тывают сине-зеленый пигмент -пиоцианин за счет которого проис­ходит окрашивание этих сред.

Образцы молока или колоний с кровяного агара, при микроскопии которых обнаружены грамотрицательные палочки, высевают на МПА и МПБ, культивируют в термостате при температуре 37°С в течение 24-48ч, дополнительно до 72 ч.

Появление сине-зеленого окрашивания МПБ и МПА, роста гладких плоских колоний с ровными или изрезанными краями указывает на рост синегнойной палочки, вырабатывающей пигмент пиоционин.

Из МПБ и МПА делают мазки,окрашивают по Грамму и просматривают под микроскопом.

При обнаружении в мазках грамотрицательных палочек и измене­нии цвета сред в сине-зеленый ставят реакцию для обнаружения пиоционина.

Определение пиоционина. В пробирку с МПБ добавляют 1 мл хлороформа, пробирку встряхивают.

При положительной реакции хлороформ приобретает зеленый цвет и опускается на дно пробирки.

У пигментообразующих сапрофитных бактерии в хлороформе пиг­мент не растворяется.

д) Выделение грибов рода Саndida

Пробы молока в количестве по 0,1-0,3мл высевают на 2чашки Петри с элективной дифференциально-диагностической средой (рецепт11),равномерно распределяя материал по поверхности стерильным шпателем. Засеянные чашки помещают в термостат вверх дном при температуре 37°С на 18-20ч.

Контролем служит посев культуры этого гриба на ту же самую элективную дифференциально-диагностическую среду.

После инкубации чашки Петри просматривают, из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают их по Грамму или другими метода­ми, а также делают посев на ту же самую среду для выделения чис­той культуры и выявления псевдомицелия. Засеянные пробирки выдер­живают в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч, затем выдерживают при комнатной температуре 2суток.

Первичный учет делают через 21-24ч после инкубации материа­ла, а окончательный -на 4-й день исследования.

Колонии грибов рода Саndidaгладкие, морщинистые, плоские, беловато-серые, кремо-беловатые, кремовые, мягкой консистенции, кожистые.

При микроскопии обнаруживают псевдомицелий, а также почкую­щиеся клетки (споры, истинный мицелий, -иногда хламидоспоры).

Схема идентификации кокковой микрофлоры молока по В.Д. Парикову, В.И. Сдободянику и др.

Пробы молока (секрета) высевают на секторы (4,8)кровяного МПА в чашках Петри, выдерживают в термостате 24ч при температуре 37°С,учитывают характер роста и вид гемолиза. Из колоний, характерных для кокковых микроорганизмов, делают посев на секторы (8) кровяного МПА для получения чистых культур. Из других колоний де­лают мазки, красят их по Грамму и микроскопируют. Чашки Петри с отсеянными микроорганизмами инкубируют в термостате при темпера­туре 37°С 24ч.

Выросшие чистые культуры кокковых микроорганизмов проверяют на каталазу с 3% перекисью водорода на предметном стекле, а также готовят мазки, красят по Грамму и микроскопируют. Каталазоположительные микроорганизмы относят к стафилококкам, а каталазоотрицательные -к стрептококкам.

Дифференциация стафилококков

Учет роста на кровяном МПА, вид гемолиза, микроскопию, постановку ТОК проводят как , как описано раньше.

Анаэробная ферментация манита.Среду (рецепт 12)перед применением ставят в водяную баню и кипятят 10-15 мин для удаления растворенного кислорода, охлаждают до 45-50°С и вносят на дно пробирки бактериологической петлей чистую культуру стафилококка. Поверхность среды покрывают стерильным вазелиновым маслом или парафином, слоем 2см. Пробы культивируют в термостате при темпера­туре 37°С в течение 5дней.

Отсутствие желтого окрашивания или пожелтение только поверх­ности среды свидетельствует об отсутствии анаэробной ферментации манита.

Анаэробная ферментация глюкозы.Используют среду, приготов­ленную по рецепту 12,в котором применяют глюкозу вместо манита, и проводят исследование по аналогичной схеме.

б) Дифференциация стрептококков

Каталазоотрицательные культуры кокковых микроорганизмов про­веряют по КАМП-тесту на среде с эскулином (рецепт 13)по схемам.

Проводят по наличию просветления в зоне β-гемолиза -гемолитического стафилококка и по цвету колоний. Около 5% штаммовStr.agalactiaeдают КАМП тест отрицательный и около 30% штаммовStr.uberisдают КАМП тест положительный.