Определение лактоферрина

В основу метода положен метод Манчини, который основан на изменении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесе­нии исследуемой сыворотки молока, в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.

Подготовка к анализу:

1)Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3%гель агар «Дифко», приготовленный на 0,033М фос­фатном буфере с рН 8,0,содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной в 60раз и нагретой до этой же темпе­ратуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластинку помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной 1мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смо­ченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.

2)Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при2000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и моло­ко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

3)Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика используют стандартный лактоферрин в концентрациях 175, 350, 700, 1400, 2800мкг./мл, разведенный в 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0,содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.

Проведение анализа:

В слое агара с антисывороткой пробойникам вырезают рядами лунки диаметром 2мм на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2мкл разведения стандартного лактоферрина. Лунки следующих рядов заполняют иссле­дуемыми молочными сыворотками в том же объеме. Агаровые пластины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 4-3ч, затем окрашивают амидо-черным Б.

Обработка результатов:

С помощью чертежного измерителя или штангенциркуля измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный график зависи­мости логарифма концентрации стандартного лактоферрина в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации о антисывороткой.

На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диа­метры колец преципитации стандартным лактоферрином, а по оси ор­динат -известное количество лактоферрина, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой.

Определение концентрации лактоферрина в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.

уклинически здоровых коров после родов и в середине лактации количество лактоферрина составляет 53-65мкг/мл, у больных маститом - 251-330мкг/мл, к концу лактации (период запуска) оно возрастает до 481,9±34,5 мет/мл и 2559,0±170,4 мкг/мл соответственно.

Определение активности лактопероксидазы

а) Метод Б.П. Плешкова.

Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии лактопероксидазы с обра­зованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520нм.

Подготовка к анализу:

1)Приготовление 2,5мМ раствора бензидина.

184,2мг бензидина растворяют в смеси 100мл дистиллирован­ной воды и 2,3мл ледяной уксусной кислоты. После полного раство­рения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нем 5,45г трех­водного уксуснокислого натрия и доводят общий объем раствора дистиллированной водой до 400мл.

2) Приготовление 0,333н перекиси водорода.

К 0,6мл перекиси водорода добавляют 99,4мл дистиллирован­ной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раст­вором перманганата калия (НКМn0₄). На титрование 3,0мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода дово­дят до нужной концентрации дистиллированной водой.

3) Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при2000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко наг­ревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Оборудование и аппаратура:

1. Спектрофотометр с термостатируемой кюветой.

2. Секундомер.

3. Ультратермостат.

4. Бюретка для титрования.

5. Пробирки химические.

6. Весы аналитические.

Проведение анализа:

В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10 мм наливает2,0мл раствора бензидина и 0,5мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содержимое кюветы перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны520нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60с (по секундомеру) определяют оптическую плот­ность.

Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плот­ности контрольной пробы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1мл дистиллированной воды.

Обработка результатов:

Активность лактопероксидазы рассчитывают по формуле и выра­жают в условных единицах активности (УЕА).

(Ео-Ек) х 10

УЕА = ------------------------------- ,

60

где УЕА -активность фермента, Ед ОП/мл;

Ео -оптическая плотность опытной пробы;

Ек -оптическая плотность контрольной пробы;

10 -коэффициент пересчета в 1мл;

60 -время проведения реакции, с.;

УЕА -изменение оптической плотности на 0,01за 1с одним мл сыворотки молока.

б) Модифицированный метод Орам и Рейтер.

Подготовка к анализу:

1)Приготовление 0,1М фосфатного буфера, рН 6,7. 6,8г двузамещенного фосфорнокислого калия (КН₂РО₄) раство­ряют в 500мл дистиллированной воды и 11,4г водного однозамещенного фосфорнокислого калия (КН₂РО₄ х 3Н₂О) растворяют в 500мл дис­тиллированной воды. В раствор двузамещенного фосфорнокислого ка­лия под контролем рН-метра приливают раствор однозамещенного фос­форнокислого калия до установления рН 6,7.

2)Приготовление 0,01% раствора ортодианизидина.10мг орто-дианизидина растворяют в 100мл 0,1М фосфатного буфера с рН 6,7.

3)Приготовление молочной сыворотки.

Пробу молока центрифугируют в течение 15мин при 2000об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на20-30мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и моло­ко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа:

К 3мл 0,01% раствора орто-дианизидина добавляют 0,1мл исс­ледуемой сыворотки молока, тщательно перемешивают и определяют экстинцию на спектрофотометре при длине волны 460нм с рабочей длиной кюветы 10 мм.Затем в кювету доливают 0,1мл 9мМ перекиси водорода, хорошо перемешивают и выдерживают в водяной бане или термостате при температуре 37°С 5мин. Снова измеряют экстинцию при той же длине волны.