3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков

Изоэлектрической точкой белка называется определенная величина рН среды, при которой белок находится в виде нейтральных молекул (в изоэлектрическом состоянии), несущих равные количества положительных и отрицательных зарядов. При других концентрациях ионов водорода в растворе имеются преимущественно положительные и отрицательные ионы белка. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но не вполне совпадает с ней, для многих белков она сдвинута в кислую сторону, а некоторые белки имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной реакции среды. Определение изоэлектрической точки может быть сведено к определению рН раствора, при котором наблюдается наиболее быстрое и полное выпадение белка в осадок.

Работа 24. Определение изоэлектрической точки казеина

Исследуемый материал: молоко.

Реактивы: 10%-ная СН₃СООН, дистиллированная вода, 0,2 М раствор СН₃СOONa, 0,2 M раствор СН₃СООН.

Оборудование: пробирки, воронка, фильтры, стеклянная палочка.

ХОД РАБОТЫ

1. Выделение казеина из молока. К 2 мл молока добавляют 2 мл дистиллированной воды и 2 капли 10%-ной уксусной кислоты. Образуется осадок казеина, который отфильтровывают. Фильтрат отбрасывают, а осадок казеина осторожно снимают с фильтра стеклянной палочкой и помещают в чистые пробирки.

2. Определение изоэлектрической точки казеина. Для определения изоэлектрической точки казеина в 7 сухих пробирок наливают нужные реактивы в количествах, указанных в таблице. При смешивании растворов в каждой пробирке устанавливается определенная концентрация ионов водорода. Содержимое пробирок хорошо перемешивают. Через 5-10 мин во всех пробирках появляется осадок (помутнение). Наибольшее количество осадка наблюдается в той пробирке, рН которой соответствует изоэлектрической точке данного белка.

Количество 0,2М CH3COOH, мл	Количество H2O, мл	Количество 0,4%-го раствора казеина в 0,2 М CH3COONa, мл	рН смеси	Степень помутнения
1,6 0,8 0,4 0,2 0,1 0,06 0,3	0,4 1,2 1,6 1,8 1,9 1,94 1,97	0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2	3,8 4,1 4,4 4,7 5,0 5,3 5,6

Оформление. Результаты опытов представить в таблице. В графе «Степень помутнения» отсутствие осадка обозначить знаком минус (-), наличие его – знаком плюс (+), значительное помутнение – несколькими плюсами.

Контрольные вопросы

1. Как ведут себя аминокислоты и белки в водном растворе и в присутствии избытка кислоты и щелочи?

2. От чего зависит заряд белка в водном растворе?

3. От чего зависит растворимость белка? Какие факторы стабилизируют белок в растворе?

4. Каковы общие механизмы осаждения белка из раствора? Какими способами можно осадить белок, не вызывая его денатурацию?

5. Что такое изоэлектрическая точка и как ее определить?

6. Что такое высаливание белка?

7. Что такое денатурация белка? Какие агенты, денатурирующие белки, вам известны?

8. В чем заключается разница между осаждением и денатурацией?

9. Каким образом можно разделить альбумины и глобулины сыворотки крови?

10. Назовите мероприятия при отравлении человека солями тяжелых металлов, основанные на необратимых реакциях осаждения белка.