- •Биологическая химия и молекулярная биология Руководство к лабораторным работам
- •Содержание
- •Рабочая программа курса «биохимия и молекулярная биология»
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Часть 1 Раздел 1 Углеводы
- •Открытие углеводов в растворах
- •2. Восстанавливающие свойства углеводов
- •1.3. Полисахариды Работа 6. Кислотный гидролиз крахмала
- •Работа 7. Выделение гликогена из печени
- •Раздел 2. Липиды
- •Работа 8. Определение кислотного числа
- •Работа 9. Определение числа омыления
- •Работа 11. Качественные реакции на обнаружение витамина е
- •Работа 12. Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту
- •Раздел 3 Белки
- •3.1. Химическая природа белка (цветные реакции)
- •3. 2. Физико-химические свойства белка
- •3.2.1. Реакции осаждения белков
- •3.2.2. Растворимость белков
- •Высаливание белков
- •3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков
- •3. 3. Гидролиз белков
- •Качественные реакции на открытие составных частей сложных белков
- •Раздел 4 Нуклеотиды
- •Работа 29. Исследование состава нуклеиновых кислот
- •Раздел 5. Витамины
- •Работа 30. Количественное определение аскорбиновой кислоты
- •Работа 31. Количественное определение витамина р в чае
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 6. Ферменты
- •6.1. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
- •Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность холинэстерзы
- •6.2. Влияние рН на скорость ферментативных реакций
- •Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны
- •Влияние рН на активность амилазы слюны
- •6.3. Специфичность действия ферментов
- •Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны
- •Работа 36. Специфичность действия сахаразы
- •6.4. Открытие ферментов различных классов
- •Работа 37. Идентификация оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Буферные растворы
- •Фосфатный буфер (0,1м), рН 5,8-8,0
- •Бикарбонатный буфер (0,1 м), рН 9,2-10,8
- •Трис-буфер (0,05 м), рН 7,2-9,1
- •Раздел 2. Обмен углеводов
- •Работа 43. Количественное определение углеводов
- •Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом
- •Работа 44. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 45. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 46. Определение гликолитической активности эритроцитов
- •Работа 47. Количественное определение содержания гликогена в печени и скелетных мышцах крысы
- •Раздел 3. Биоэнергетика
- •Работа 48. Сравнительное изучение активности сукцинатдегидрогеназы в различных тканях крыс и ее конкурентное торможение
- •Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атр и креатинфосфата)
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 4. Обмен липидов Работа 50. Исследование действия липазы поджелудочной железы.
- •Работа 51. Определение общих липидов в сыворотке крови
- •Работа 52. Количественное определение липопротеинов низкой плотности (лпнп) в сыворотке крови
- •Работа 53. Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)
- •Работа 54. Определение общих фосфолипидов в плазме крови
- •Раздел 5. Обмен нуклеиновых кислот
- •Работа 55. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
- •Работа 56. Определение температуры «плавления» водородных связей
- •Работа 57. Определение содержания мочевой кислоты
- •Работа 58. Определение активности рибонуклеазы
- •Раздел 6. Обмен белков и аминокислот Работа 59. Количественное определение белка
- •1. Биуретовый метод
- •2. Микробиуретовый метод
- •3. Метод Брэдфорд
- •4. Спектрофотометричекий метод
- •Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 61. Определение активности аргиназы печени
- •Работа 62. Количественное определение креатинина в моче и сыворотке крови
- •Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы
- •Работа 64. Переаминирование аминокислот
- •Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению рнк и днк к белку
Работа 62. Количественное определение креатинина в моче и сыворотке крови
Креатинин является одним из конечных продуктов азотистого обмена и нормальной составной частью мочи. За сутки с мочой выделяется креатинина у мужчин 8,8-17,7 ммоль (1-2 г/сут), а у женщин – 1,7-15,9 ммоль (0,8-1,8 г/сут). Креатинин - ангидрид креатина. Креатин содержится в мышцах (около 80%), особенно в сердечной, где из него при участии АТР образуется макроэргическое соединение креатинфосфат, при распаде которого образуется креатинин и фосфат. Креатин в моче взрослого здорового человека отсутствует, появление его в моче называют креатинурией. Однако у детей и подростков моча всегда содержит креатин.
Принцип метода. Креатинин при взаимодействии с пикриновой кислотой в щелочной среде образует окрашенные соединения, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации креатинина в моче и сыворотке крови.
Исследуемый материал: моча, сыворотка крови.
Реактивы: стандартный раствор креатинина (177 мкмоль/л), 2%-ный раствор пикриновой кислоты, 10%-ный раствор NaOH, 5%-ный раствор ТХУ, дистиллированная вода.
Оборудование: пробирки. пипетки, ФЭК, кюветы.
ХОД РАБОТЫ. В трех пробирках смешивают реактивы по схеме:
Реактивы (мл) |
Опытная проба |
Стандарт |
Контроль |
Сыворотка |
0,5 |
- |
- |
Дистиллированная вода |
1 |
1 |
1,5 |
ТХУ |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Стандартный раствор |
- |
0,5 |
- |
Через 5 мин опытную пробу и стандартную пробы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. С надосадочной жидкостью готовят следующие пробы:
Реактивы (мл) |
Опытная проба |
Стандарт |
Контроль |
Надосадочная жидкость |
1,0 |
1,0 |
1.0 |
Пикриновая кислота |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
NaOH |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Перемешивают и через 20 мин колориметрируют опытную и стандартную пробы при зеленом светофильтре (540 нм) в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Расчет проводят по формуле:
С (мкмоль/л) = 177 · Аоп /А ст.
Перед определением содержания крекатинина мочу разводят в 100 раз. Это разведение учитывают при расчетах. В опытной пробе смешивают о,5 мл мочи, 0,25 мл дистиллированной воды, 0,25 мл ТХУ, 0,5 мл пикриновой кислоты, 0,5 мл NaOH. Через 20 мин колориметрируют на зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) в кювете толщиной 0,5 см против контроля, приготовленного в предыдущей работе. Расcчитывают концентрацию креатинина в моче по формуле с учетом ее разведения:
С (мкмоль/л) =50 ·177 · Аоп /А ст.
Содержание креатинина суточной моче рассчитываю по формуле
С · 1,5 / 1000 = ммоль/сут,
где С – концентрация креатинина в моче в мкмоль/л; 1,5 – суточный диурез в литрах, 1000 – коэффициент перевода мкмоль в ммоль.
Норма креатинина в сыворотке крови – 53-106 мкмоль/л, в суточной моче – 4,4-17,6 ммоль/сутки.
Клиренс креатинина (его очищение рассчитывают по формуле
1,07 С /С ,
где1,07 минурный диурез. В норме клиренс по креатинину составляет 80 – 120 мл/мин.
Клинико-диагностическое значение. Определение креатинина проводят для исследования функции почек. Содержание его в сыворотке крови увеличивается при значительном ухудшении функции почек. Креатинемия наблюдается также при закупорке мочевых путей, кишечной непроходимости, тяжелом диабете, механической желтухе, гипофункции надпочечников, голодании. Увеличение креатинина в моче наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях, пневмонии, выраженной недостаточной функции печени. Понижение креатинина в моче – при мышечной дистрофии, голодании, дегенерации почек, лейкемии. Расчет клиренса креатинина позволяет получить информацию об интенсивности основных функций фильтрации, реабсорбции, секреции и почечном кровообращении.