Работа 56. Определение температуры «плавления» водородных связей

Соответствующие пары азотистых оснований нативной ДНК упорядоченно связаны между собой водородными связями, температура плавления которых носит характер одномоментного кооперативного процесса. Поэтому при исследовании зависимости Е_р от температуры в случае нативных образцов ДНК наблюдается ярко выраженный фазовый переход, т.е. в узком температурном интервале происходит резкий прирост значения Е_р. В денатурированных образцах ДНК, где водородные связи не упорядочены, последние разрушаются постепенно, при разных температурах. Таким образом, исследование температурных зависимостей Е_р является одним из тестов на нативность ДНК. Замечено, что значение температуры «плавления» ДНК коррелирует с содержанием в ее молекуле ГЦ-пар.

Исследуемый материал: препарат ДНК.

Реактивы: стандартный солевой раствор, содержащий хлорид натрия (0,15 моль) и цитрат натрия (0,015 моль) в 1 л (рН=7,0).

Оборудование: спектрофотометр с термостатированной камерой.

ХОД РАБОТЫ. Препарат ДНК растворяют (из расчета 10-20 мкг ДНК в 1 мл) в стандартном солевом растворе, разбавленном в 10 раз. Раствор помещают в кварцевую кювету (1 см) с герметической крышкой для предотвращения испарения. На спектрофотометре определяют экстинкции (Е₂₆₀ нм) при разных температурах в промежутке от 25 до 95С с интервалом не более 5С и выдержкой при определенной температуре в течение 5-10 мин. Если наблюдается резкое изменение экстинкции при какой-либо температуре, это указывает на то, что исследуемая ДНК нативна; если рост экстинкции происходит постепенно, то ДНК частично денатурирована.

По результатам измерений строят кривую «плавления». Для этого по оси ординат откладывают отношения оптической плотности раствора при измеряемой температуре (t) к оптической плотности при 25С, а по оси абсцисс – температуру. Точку плавления (t_пл.) ДНК находят по кривой плавления. Она соответствует середине зоны подъема кривой относительной экстинкции.

Зависимость между точкой плавления и содержанием ГЦ-пар в ДНК определяют по формуле

с_гц = (t_пл. – 69,3) ^. 2,44,

где с_гц – содержание ГЦ-пар в молярных процентах, а 69,3 и 2,44 – постоянные коэффициенты.

Средние данные получают из 3-4 параллельных опытов.

Кривая плавления ДНК, выделенной из микроорганизма Proteus vulgaris

Работа 57. Определение содержания мочевой кислоты

В организме человека мочевая кислота – конечный продукт расщепления пуринов, который выделяется с мочой. Исследование содержания мочевой кислоты в сыворотке крови используется в диагностических целях, поскольку увеличенное содержание мочевой кислоты в сыворотке крови наблюдается при некоторых заболеваниях, в частности подагре и синдроме Леша-Нейхана.

Принцип метода определения мочевой кислоты заключается в том, что мочевая кислота восстанавливает фосфорновольфрамовый реактив, а интенсивность образующейся окраски пропорциональна концентрации мочевой кислоты.

Исследуемый материал: сыворотка крови.

Реактивы: реактив Фолина (фосфорномолибденовый реактив), 20%-ный раствор ТХУ, насыщенный раствор Na₂CO₃, стандартный раствор мочевой кислоты.

Приготовление стандартного раствора мочевой кислоты. 100 мг мочевой кислоты вносят в колбу на 500 мл. Затем в нее приливают 25 мл 0,5%-ного раствора углекислого лития, 25 мл дистиллированной воды и после растворения мочевой кислоты доводят объем дистиллированной водой до метки, предварительно добавив для стойкости 12,5 мл формалина. Раствор стоек около месяца. Из основного (20%-ного стандартного раствора) готовят 2 %-ный рабочий раствор, разводя его в 10 раз. Рабочий раствор нестоек и может храниться лишь в течение 2-3 дней. 1 мл его содержит 0,2 мг мочевой кислоты.

Оборудование: центрифуга лабораторная, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, центрифужные пробирки, стеклянные пробирки, пипетки градуированные, мерные колбы.

ХОД РАБОТЫ. В центрифужную пробирку вносят 1,5 мл сыворотки, 1,5 мл дистиллированной воды и 1,5 мл 20%-ной ТХУ. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 30 минут центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. К 1,5 мл супернатанта приливают 0,7 мл насыщенного раствора Na₂CO₃ и одну каплю реактива Фолина. Параллельно с опытной пробой обрабатывают стандартную. В пробирку помещают 0,5 мл стандартного рабочего раствора мочевой кислоты, 0,5 мл 20%-ного раствора ТХУ, 0,5 мл дистиллированной воды, 0,7 мл насыщенного раствора Na₂CO₃ и 1 каплю раствора Фолина. Через 10 мин. обе пробы колориметрируют на ФЭКе (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 5 мм против дистиллированной воды.

Расчетная формула

С_ст ^. Е_оп

С_х = ––––––––– ,

Е_ст

_где

С_х – концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови в мг%,

С_ст – концентрация мочевой кислоты в стандартной пробе,

Е_оп – экстинкция опытной пробы,

Е_ст – экстинкция стандартной пробы.

Норма содержания мочевой кислоты в сыворотке крови 2-3 мг%.