4. Спектрофотометричекий метод

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине кюветы 1,0 см).

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов, поэтому измеряют оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм.

Исследуемый материал: стандартный раствор белка, содержащий 1-5 мг/мл.

Оборудование: пробирки, пипетки, спектрофотометр, кюветы

Содержание белка находят по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм:

Содержание белка 1,45 · А₂₈₀ – 0,74 · А₂₆₀ (мг/мл)

Определить содержание белка в сыворотке крови разными методами. Полученные результаты сравнить.

Диагностическое значение. Увеличение белка в крови (гиперпротеинемия) наблюдается сравнительно редко. Относительная гиперпротеинемия наблюдается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости. Гипопротеинемия наблюдается при недостаточном поступлении белка с пищей, заболеваниях желудочно-кишечного тракта, понижении биосинтеза белка при хронических паренхиматозных гепатитах, интоксикациях, злокачественных новообразованиях. Гипопротеинеия может наблюдаться при потерях белка организмом при острых и хронических кровопотерях, увеличенной проницаемости капилляров, кровопусканиях.

Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче

С мочой у взрослого человека выделяется за сутки 20-35 г, или 333-583 ммоль мочевины. Мочевина – диамид угольной кислоты, образующийся в печени при обезвреживании аммиака. В норме в сыворотке крови содержится 3,33-8,32 ммоль/л мочевины.

Принцип метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные соединения. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации мочевины в исследуемой моче и сыворотке крови и определяется фотометрически.

Исследуемый материал: сыворотка крови, моча.

Реактивы: стандартный раствор мочевины (16,7 ммоль/л). 5%-ный раствор хлорного железа (основной раствор: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой, после чего подкисляют 1 мл концентрированной H₂SO₄; рабочий раствор готовят из основного: 1 мл основного раствора доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной H₂SO₄ и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты; раствор хранят в темной посуде). 2,5%-ный водный раствор диацетилмооксима, 0,25%-ный раствор тиосемикарбазида (хранят в темной посуде). Цветной реактив хлорида (готовят каждый раз перед употреблением): к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного диацетилмооксима и 0,25 мл 0,25%-ного тиасемикарбазида).

Оборудование: пипетки, пробирки, ФЭК, кюветы с длиной оптического

пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ. Мочу перед определением развести в 10 раз. В одну пробирку вносят 0,1 мл мочи, в другую – 0,1 мл сыворотки крови, в третью – стандартный раствор мочевины. Затем во все 3 пробирки добавляют по 2 мл рабочего раствора для определения мочевины, перемешивают и ставят на кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают в струе холодной воды и колориметрируют на зеленом светофильтре в кювете с длиной оптического пути 5 мм против воды.

Расчет производят по формуле:

167Е_оп/Е_ст (для мочи).

Клинико-диагностическое значение. Пониженное содержание мочевины в моче отмечается при нефрите, ацидозе, паренхиматозной желтухе, циррозе печени, уремии, повышенное – при недостатке белка в питании, злокачественной анемии, лихорадке, интенсивном распаде белков в организме, после приемов салицилатов, при отравлении фосфором.

Снижение содержания мочевины в сыворотке крови отмечается при паренхиматозном гепатите, циррозе (резкое снижение мочевинообразовательной функции печени), во время беременности, при эклампсии. Содержание мочевины в сыворотке может повышаться при нефритах, лихорадочных состояниях, сепсисе, туберкулезе почек.