- •Биологическая химия и молекулярная биология Руководство к лабораторным работам
- •Содержание
- •Рабочая программа курса «биохимия и молекулярная биология»
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Часть 1 Раздел 1 Углеводы
- •Открытие углеводов в растворах
- •2. Восстанавливающие свойства углеводов
- •1.3. Полисахариды Работа 6. Кислотный гидролиз крахмала
- •Работа 7. Выделение гликогена из печени
- •Раздел 2. Липиды
- •Работа 8. Определение кислотного числа
- •Работа 9. Определение числа омыления
- •Работа 11. Качественные реакции на обнаружение витамина е
- •Работа 12. Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту
- •Раздел 3 Белки
- •3.1. Химическая природа белка (цветные реакции)
- •3. 2. Физико-химические свойства белка
- •3.2.1. Реакции осаждения белков
- •3.2.2. Растворимость белков
- •Высаливание белков
- •3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков
- •3. 3. Гидролиз белков
- •Качественные реакции на открытие составных частей сложных белков
- •Раздел 4 Нуклеотиды
- •Работа 29. Исследование состава нуклеиновых кислот
- •Раздел 5. Витамины
- •Работа 30. Количественное определение аскорбиновой кислоты
- •Работа 31. Количественное определение витамина р в чае
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 6. Ферменты
- •6.1. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
- •Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность холинэстерзы
- •6.2. Влияние рН на скорость ферментативных реакций
- •Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны
- •Влияние рН на активность амилазы слюны
- •6.3. Специфичность действия ферментов
- •Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны
- •Работа 36. Специфичность действия сахаразы
- •6.4. Открытие ферментов различных классов
- •Работа 37. Идентификация оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Буферные растворы
- •Фосфатный буфер (0,1м), рН 5,8-8,0
- •Бикарбонатный буфер (0,1 м), рН 9,2-10,8
- •Трис-буфер (0,05 м), рН 7,2-9,1
- •Раздел 2. Обмен углеводов
- •Работа 43. Количественное определение углеводов
- •Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом
- •Работа 44. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 45. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 46. Определение гликолитической активности эритроцитов
- •Работа 47. Количественное определение содержания гликогена в печени и скелетных мышцах крысы
- •Раздел 3. Биоэнергетика
- •Работа 48. Сравнительное изучение активности сукцинатдегидрогеназы в различных тканях крыс и ее конкурентное торможение
- •Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атр и креатинфосфата)
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 4. Обмен липидов Работа 50. Исследование действия липазы поджелудочной железы.
- •Работа 51. Определение общих липидов в сыворотке крови
- •Работа 52. Количественное определение липопротеинов низкой плотности (лпнп) в сыворотке крови
- •Работа 53. Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)
- •Работа 54. Определение общих фосфолипидов в плазме крови
- •Раздел 5. Обмен нуклеиновых кислот
- •Работа 55. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
- •Работа 56. Определение температуры «плавления» водородных связей
- •Работа 57. Определение содержания мочевой кислоты
- •Работа 58. Определение активности рибонуклеазы
- •Раздел 6. Обмен белков и аминокислот Работа 59. Количественное определение белка
- •1. Биуретовый метод
- •2. Микробиуретовый метод
- •3. Метод Брэдфорд
- •4. Спектрофотометричекий метод
- •Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 61. Определение активности аргиназы печени
- •Работа 62. Количественное определение креатинина в моче и сыворотке крови
- •Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы
- •Работа 64. Переаминирование аминокислот
- •Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению рнк и днк к белку
6.1. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
Скорость ферментативных реакций, как и неферментативных, увеличивается при повышении температуры. Но в связи с белковой природой ферментов повышение температуры может привести к их денатурации и снижению скорости реакции. Денатурация тем значительнее, чем выше температура и чем больше время инкубации.
Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны
Исследуемый материал: слюна.
Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, реактив Люголя, дистиллированная вода.
Оборудование: пипетки, пробирки, термостат, спиртовка, ледяная баня, предметные стекла.
ХОД РАБОТЫ. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл крахмала. Еще в 4 пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:5) слюны. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая – с крахмалом) и помещают в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (37˚С), а четвертую – в кипящую водяную баню. Через 5 мин. содержимое каждой пары пробирок сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 мин при тех же условиях. Из третьей пробирки отливают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Потом добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки и наблюдают за развитием окраски.
Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о характере влияния температуры на активность амилазы.
Влияние температуры на активность амилазы слюны
№ пробирки |
Температура инкубации, ˚С |
Окрашивание с йодом |
1 |
0 |
|
2 |
20 |
|
3 |
37 |
|
4 |
100 |
|
Работа 33. Влияние температуры на активность холинэстеразы
Холинэстераза – фермент, играющий существенную роль в процессе передачи возбуждения холинэргическими нервами на воспринимающие ткани. Холинэстераза расщепляет ацетилхолин – медиатор нервного возбуждения - на холин и уксусную кислоту:
(СН3)3 +NСН2СН2-О-СО-СН3 (СН3)3 +NСН2СН2-О-СО-СН3 + СН3СООН.
В процессе реакции происходит закисление среды за счет накопления уксусной кислоты, что можно обнаружить с помощью индикатора. В работе используется двухцветный индикатор бромтимоловый синий. Зона смены окраски находится в области рН 7,6-6,0, в кислой среде окраска – желтая, в щелочной – синяя, промежуточная окраска – зеленая. Инкубацию фермента и субстрата проводят в различных температурных условиях. Об интенсивности ферментативного гидролиза ацетилхолина судят по окраске инкубационной смеси.
Исследуемый материал: сыворотка крови (разведение 1:50) – источник холинэстеразы.
Реактив: 0,5%-ный раствор ацетилхолина (готовят на дистиллированной воде,освобож-
денной от СО ),0,02%-ный раствор бромтимолового синего (2,5 г сухого индикатора растирают в ступке с 4,5 мл 0,1 н раствора едкого натра, полученный раствор переносят в мерную колбу на 50 мл, добавляют 12,5 мл 0,1 н раствора борной кислоты, приготовленного на 0,1М растворе КCl, раствор доводят водой до метки, перед опытом раствор разводят водой в 2 раза).
Оборудование: пробирки, пипетки, термостат, баня со льдом.
ХОД РАБОТЫ. Берут 3 пробирки. Вносят в каждую по 2,5 мл сыворотки крови и по 0,5 мл бромтимолового синего. Одну из пробирок помещают в термостат (37˚С), вторую оставляют при комнатной температуре, третью помещают в ледяную баню. Через 5 мин, необходимых для выравнивания температуры, во все 3 пробирки вносят по 0,5 мл раствора ацетилхолина. Содержимое пробирок перемешивают и вновь оставляют в соответствующих температурных условиях. Через 10-15 мин отмечают цвет в каждой пробирке.
Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о зависимости скорости реакции от температуры.