- •Биологическая химия и молекулярная биология Руководство к лабораторным работам
- •Содержание
- •Рабочая программа курса «биохимия и молекулярная биология»
- •Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории
- •Часть 1 Раздел 1 Углеводы
- •Открытие углеводов в растворах
- •2. Восстанавливающие свойства углеводов
- •1.3. Полисахариды Работа 6. Кислотный гидролиз крахмала
- •Работа 7. Выделение гликогена из печени
- •Раздел 2. Липиды
- •Работа 8. Определение кислотного числа
- •Работа 9. Определение числа омыления
- •Работа 11. Качественные реакции на обнаружение витамина е
- •Работа 12. Качественные реакции на ацетон и ацетоуксусную кислоту
- •Раздел 3 Белки
- •3.1. Химическая природа белка (цветные реакции)
- •3. 2. Физико-химические свойства белка
- •3.2.1. Реакции осаждения белков
- •3.2.2. Растворимость белков
- •Высаливание белков
- •3.2.4. Определение изоэлектрической точки белков
- •3. 3. Гидролиз белков
- •Качественные реакции на открытие составных частей сложных белков
- •Раздел 4 Нуклеотиды
- •Работа 29. Исследование состава нуклеиновых кислот
- •Раздел 5. Витамины
- •Работа 30. Количественное определение аскорбиновой кислоты
- •Работа 31. Количественное определение витамина р в чае
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 6. Ферменты
- •6.1. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции
- •Работа 32. Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность амилазы слюны
- •Влияние температуры на активность холинэстерзы
- •6.2. Влияние рН на скорость ферментативных реакций
- •Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны
- •Влияние рН на активность амилазы слюны
- •6.3. Специфичность действия ферментов
- •Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны
- •Работа 36. Специфичность действия сахаразы
- •6.4. Открытие ферментов различных классов
- •Работа 37. Идентификация оксидоредуктаз в биологическом материале
- •Буферные растворы
- •Фосфатный буфер (0,1м), рН 5,8-8,0
- •Бикарбонатный буфер (0,1 м), рН 9,2-10,8
- •Трис-буфер (0,05 м), рН 7,2-9,1
- •Раздел 2. Обмен углеводов
- •Работа 43. Количественное определение углеводов
- •Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом
- •Работа 44. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 45. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови
- •Работа 46. Определение гликолитической активности эритроцитов
- •Работа 47. Количественное определение содержания гликогена в печени и скелетных мышцах крысы
- •Раздел 3. Биоэнергетика
- •Работа 48. Сравнительное изучение активности сукцинатдегидрогеназы в различных тканях крыс и ее конкурентное торможение
- •Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (атр и креатинфосфата)
- •Контрольные вопросы
- •Раздел 4. Обмен липидов Работа 50. Исследование действия липазы поджелудочной железы.
- •Работа 51. Определение общих липидов в сыворотке крови
- •Работа 52. Количественное определение липопротеинов низкой плотности (лпнп) в сыворотке крови
- •Работа 53. Определение общего холестерина в сыворотке крови, основанное на реакции Либермана-Бурхарда (метод Илька)
- •Работа 54. Определение общих фосфолипидов в плазме крови
- •Раздел 5. Обмен нуклеиновых кислот
- •Работа 55. Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот
- •Работа 56. Определение температуры «плавления» водородных связей
- •Работа 57. Определение содержания мочевой кислоты
- •Работа 58. Определение активности рибонуклеазы
- •Раздел 6. Обмен белков и аминокислот Работа 59. Количественное определение белка
- •1. Биуретовый метод
- •2. Микробиуретовый метод
- •3. Метод Брэдфорд
- •4. Спектрофотометричекий метод
- •Работа 60. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови и моче
- •Работа 61. Определение активности аргиназы печени
- •Работа 62. Количественное определение креатинина в моче и сыворотке крови
- •Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы
- •Работа 64. Переаминирование аминокислот
- •Работа 65. Оценка биосинтетической функции ткани по соотношению рнк и днк к белку
Влияние температуры на активность холинэстерзы
№ пробирки |
Температура инкубации, ˚С |
Окрашивание с бромтимоловым синим |
1 |
0 |
|
2 |
20 |
|
3 |
37 |
|
4 |
100 |
|
6.2. Влияние рН на скорость ферментативных реакций
Все ферменты проявляют максимальную активность при определенном оптимальном значении рН. Ниже и выше оптимума рН наблюдается снижение активности ферментов. Зависимость активности от рН объясняется влиянием на степень ионизации ионогенных групп фермента, а также субстрата.
Работа 34. Влияние рН на активность амилазы слюны
Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судит по реакции крахмала с раствором йода. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутсвует). По мере удаления от оптимума рН в кислую или щелочную зоны расщепление крахмала произойдет только частично до стадии декстринов или крахмал вообще не подвергнется расщеплению.
Исследуемый материал: слюна.
Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, реактив Люголя, 1/15М растворы фосфатного буфера с разными значениями рН (5,5-8,0).
Оборудование: пробирки, пипетки, термостат.
ХОД РАБОТЫ. Наливают в 4 пробирки по 0,5 мл крахмала, 0,5 мл разбавленной (1:5) слюны. Затем в первую пробирку добавляют 0,5 мл буфера с рН 5,8, во вторую пробирку – 0,5 мл буфера с рН 6,5, в третью – 0,5 мл буфера с рН 7,0 и в четвертую – 0,5 мл буфера с рН 8,0. Помещают все пробирки на 10 мин в термостат (37˚С). После этого добавляют по 2 капли реактива Люголя во все пробирки и наблюдают за развитием окраски.
Оформление работы. Результаты записывают в таблицу. Делают выводы о характере влияния рН на активность амилазы.
Влияние рН на активность амилазы слюны
№ пробирки |
РН |
Окрашивание с йодом |
1 |
5,5 |
|
2 |
6,5 |
|
3 |
7,0 |
|
4 |
8,0 |
|
6.3. Специфичность действия ферментов
Специфичность действия выражается в способности ферментов катализировать реакции одного стереоизомера, одного определенного субстрата или группы сходных по строению субстратов, характеризующихся определенным типом химической связи или наличием определенной химической группировки. Это свойство наиболее важное среди свойств биологических катализаторов. Оно обусловлено наличием в молекуле фермента активного центра, ответственного за каталитическую активность, формирование которого происходит под влиянием субстрата в момент взаимодействия. Специфичность действия в работе изучается на примере α-амилазы слюны и сахаразы, полученной из дрожжей.
Работа 35. Специфичность действия α-амилазы слюны
α-амилаза катализирует гидролитическое расщепление крахмала с образованием мальтозы. Промежуточными продуктами в данной реакции являются различные декстрины ( амино-, эритро-, ахро-, мальтодекстрины). Степень гидролиза крахмала можно контролировать по цветной реакции с йодом. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, декстрины в зависимости от размеров молекул окрашиваются с йодом в разные цвета (сине-фиолетовый, красно-бурый, желто-бурый), а конечные продукты с йодом окраски не дают. Второй контрольной пробой может быть реакция на наличие свободных альдегидных групп.
Исследуемый материал: слюна
Реактивы: 1%-ный раствор крахмала, 1%-ный раствор сахарозы, 10%-ный раствор NaOH, 1%-ный раствор CuSO4, реактив Люголя, дистиллированная вода.
Оборудование: пробирки, пипетки, термостат.
ХОД РАБОТЫ. Готовят 2 инкубационные пробы, как указано в таблице, используя в качестве субстратов для амилазы 2 вещества – крахмал и сахарозу.
№ пробы |
Амилаза слюны (мл) |
Крахмал (мл) |
Сахароза (мл) |
Реакция Троммера (+, -) |
Реакция с йодом (+,-) |
1 |
1 |
1 |
|
|
|
2 |
1 |
|
1 |
|
|
Пробы выдерживают в термостате 15 мин при 37˚С. Затем с первой пробой проделывают 2 реакции: Троммера и реакцию с йодом. Со второй пробой проделывают реакцию Троммера.
Оформление работы. Вносят в таблицу результаты реакций. Делают вывод о специфичности амилазы.