Работа 58. Определение активности рибонуклеазы

Нуклеиновые кислоты вовлекаются в деструктивный обмен при участии разнообразных нуклеаз. Существует несколько методов выявления их активности . Чаще всего пользуются измерением экстинкции при 260 нм до и после ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот, реже - измерением содержания фосфора или пентоз. Активность нуклеаз определяют также по изменению вязкости раствора ДНК в процессе гидролиза и по величине гиперхромного эффекта.

Данный метод основан на том, что под влиянием рибонуклеазы (КФ 2.7.7.16) происходит расщепление фосфодиэфирных связей в молекуле РНК с образованием свободных кислых групп, которые обнаруживаются титрованием.

Исследуемый материал: разбавленная в 10 раз моча; кровь; 5%-ные водные гомогенаты тканей в количестве 0,5 мл.

Оборудование: холодильник, бюретка, пипетки на 1, 5, 10 мл, колбы конические на 50 мл.

Реактивы: раствор дрожжевой РНК (1%-ный) в ацетате натрия (0,1 М), NaOH (0,02 н.), фенолфталеин (0,5 %-ный спиртовой раствор).

ХОД РАБОТЫ. В две конические колбы вносят по 10 мл 1%-ного раствора дрожжевой РНК в 0,1 М растворе ацетата натрия. В одну колбу добавляют 0,2 мл 0,1%-ного раствора РНКазы, в другую – 0,2 мл воды. Содержимое колб перемешивают и смесь оставляют при 5С на 1 ч. По истечении указанного времени из содержимого каждой колбы отбирают по 0,5 мл, добавляют по 2 капли фенолфталеина и титруют 0,02 н раствором гидроксида натрия до появления розового окрашивания. Оставшуюся смесь в колбах оставляют еще на 1 ч при 5С. Затем из опыта и контроля берут пробы по 5 мл и оттитровывают их. Об активности РНКазы судят по разнице между количеством фосфатных групп в опытной и в контрольной пробах.

Если вместо раствора РНКазы используется слюна, кровь, моча или водные гомогенаты тканей, то вместо воды в контрольную пробу добавляют тот же объем биологической жидкости, что и в опыте, перемешивают, и немедленно фильтруют или центрифугируют и сразу же титруют 0,02 н раствором гидроксида натрия. Опытную пробу инкубируют 1-2 ч и обрабатывают затем подобным образом.

Контрольные вопросы

1. Биологические функции нуклеотидов и полинуклеотидов.

2. Строение нуклеотидов и полинуклеотидов.

3. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых оснований.

4. Катаболизм пуриновых и пиримидиновых оснований.

5. Нарушение обмена пуриновых и пиримидиновых оснований.

Раздел 6. Обмен белков и аминокислот Работа 59. Количественное определение белка

Для количественного определения белков используют физические, химические и биологические методы.

Из физических методов простейшим является взвешивание чистого белка. Однако белки очень гигроскопичны, и полностью удалить из их состава воду очень трудно, поэтому этот способ применяют редко.

Наибольшее распространение из физических методов количественного определения белков получили три – рефрактометрический (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой области спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок), пикнографический метод (по плотности белковых растворов).

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простой химический метод определения - количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от растворимых азотсодержащих веществ) азота.

Самым распространенным методом количественного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности цветных реакций, развивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специфическим реагентом. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят калибровочный график.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической активности препарата, можно составить представление о содержании в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод не дает абсолютных результатов.