Определение содержания глюкозы в сыворотке крови энзиматическим методом

Принцип метода. Метод основан на специфическом окислении глюкозы под влиянием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4), обладающей высокой субстратной специфичностью по отношению к глюкозе. Этот метод позволяет определить содержание глюкозы в крови в присутствии других восстанавливающих веществ.

Глюкозооксидаза - флавопротеин, простетической группой которого является FAD⁺. Окисление глюкозы глюкозооксидазой происходит у первого углеродного атома до глюконовой кислоты через промежуточный продукт δ-глюконолактон. Перенос двух атомов водорода на FAD⁺ приводит к его восстановлению, а затем FADH₂ передает их на кислород с образованием перекиси водорода в эквимолярных количествах. Образовавшийся пероксид водорода определяется по реакции окислительной конденсации хлорпроизводного фенола с 4-аминофеназоном, катализируемой пероксидазой. Интенсивность возникшей окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на ФЭКе (длина волны 500 нм, кювета с длиной светового пути 5 мм).

Исследуемый материал: кровь.

Реактивы: эталонный раствор глюкозы (10 ммоль/л), дистиллированная вода, рабочий реактив (содержит глюкозооксидазу, пероксидазу, 4-хлор-3-метилфенол, 4-аминофеназон).

Оборудование: пробирки центрифужные, пробирки химические, микропипетки, стеклянные пипетки, кюветы с длиной оптического пути 5 мм, ФЭК, центрифуга, термостат.

ХОД РАБОТЫ. Из ушной вены кролика собирается 2 мл крови. Для образования сгустка цельную кровь выдерживают при комнатной температуре 5 мин. После этого кровь центрифугируется на центрифуге 10 мин при скорости вращения ротора 3000 об/мин для получения сыворотки. В полученной сыворотке крови определяют содержание глюкозы. Для этого готовят пробы, согласно приведенной таблице.

Раствор	Исследуемая проба (А)	Эталон (Э)	Контроль
Сыворотка крови (мл)	0,02
Глюкоза (мл)		0,02
Дистиллированная вода (мл)			0,02
Рабочий реактив	3	3	3

Содержимое каждой пробирки перемешивают, после чего пробирки помещают в термостат на 15 мин при температуре 37ºС.

Измеряют оптическую плотность опытных проб (А) и эталона (Э) против контрольного раствора на ФЭКе (длина волны 500 нм).

Расчет производят по формуле:

Глюкоза (ммоль/л)=10·А/Э.

Содержание глюкозы в сыворотке крови у человека в норме колеблется от 3,6 ммоль/л до 6,7 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение. Увеличение содержание глюкозы в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, остром панкреатите, панкреатических некрозах, эмоциональных стрессах, после эфирного наркоза, обильного приема углеводов с пищей, а также при повышении гормональной активности ряда желез (щитовидной, гипофиза, коркового и мозгового вещества надпочечников). Снижение уровня глюкозы в крови (гипогликемия) встречается при поражении паренхимы печени, нарушении ферментативной активности при распаде гликогена, недостаточной функции щитовидной железы, надпочечников, гипофиза, передозировке инсулина при лечении сахарного диабета, нарушении всасывания углеводов, отравлениях фосфором, бензолом, хлороформом, при недостатке приема с пищей углеводов, после больших потерь крови.