Лабораторна робота №7 кількісне визначення амінокислот

Мета роботи:

Завдання 1:

Завдання 2:

Завдання 3:

Мета роботи полягає в опануванні методів кількісного визначення амінокислот.

Відомо багато методів кількісного визначення амінокислот: хімічні, хроматографічні, мікробіологічні і ферментативні.

Основні методи кількісного визначення амінокислот базуються на визначенні карбоксильних і амінних груп. Найбільшого використання завдяки своїй простоті виконання набули методи формольного титрування, визначення змінного азоту мідним способом і за реакцією з нінгідрином.

7.1. Кількісне та якісне визначення амінокислот методом розподільної хроматографії на папері

7.1.1. Якісне визначення амінокислот

Хід роботи

На хроматографічному папері олівцем відмічають лінію старту (2-3 см від краю) і точки нанесення різних стандартних сумішей амінокислот. За допомогою автоматичної мікропіпетки наносять на папір один об'єм кожної суміші на відмічену точку. Стандартний розчин може містити кілька амінокислот, плями, які не перекриваються на хроматограмі за одноразового пропускання розчинника.

Під час використання як рухомого розчинника суміші н-бутанолу—оцтової кислоти—води використовуються суміші амінокислот такого складу:

Ліз—Глу—-Фен;

Apr—Лей—Глі;

Цис—Тре—Вал;

Гіст—Сер—Мет.

На п'яту точку наносять один об'єм невідомої суміші амінокислот.

Після нанесення всіх сумішей амінокислот папір висушують на повітрі і поміщають у хроматографічну камеру з розчинником так, щоб кінець його був занурений на 1,5-2 см в розчинник; верхній край паперу закріплюють тримачем і місткість закривають.

Для чіткого розділення суміші амінокислот розчинник пропускають через папір 2-3 рази протягом 12-20 годин. Перед повторним пропусканням розчинника папір висушують у витяжній шафі.

Після закінчення хроматографічного розділення амінокислот папір 1-1,5 год висушують у чистій витяжній шафі при кімнатній температурі. Потім хроматограму занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м розчином нінгідрину в аце­тоні, просушують на повітрі і 15 хв прогрівають для проявлення забарвлення в термостаті чи сушильній шафі при 60 °С

Після проявлення хроматограми встановлюють амінокислотний склад аналізованої суміші, порівнюючи положення окремих амінокислот невідомої суміші з положенням стандартів.

Робота з органічними розчинниками проводиться у витяжній шафі.

7.1.2. Кількісне визначення амінокислот

Метод доцільний для кількісного визначення амінокислот після їх хроматографічного розділення на папері.

Основа методу — реакція амінокислот з нінгідрином у слабокислому середовищі з .подальшим перетворенням отриманого в результаті реакції синьо-фіолетового похідного — дикетоіідринделідевдікетогі.дрин-даміну (ДІДА — "фіолетова Руемана") в стабільне мідне похідне оранжево-червоного кольору, яке має максимум поглинання при 530 мкм.

Кількісне визначення амінокислот базується на вимірюванні оптичної густини Сu-похідного ДІДА після його вимивання з паперу. Лінійна залежність між вмістом амінокислот у плямі та оптичною густиною забарвлення залишається між 0,025 та 0,25 мкм амінокислоти.

Метод застосовується для визначення всіх амінокислот, за винятком проліну і оксипроліну, які інакше реагують з нінгідрином і утворюють мідне похідне іншої будови.

За допомогою даного методу можливе кількісне визначення вільних амінокислот білкових гідролізатів, крові, сечі, екстракту з тканин та інших біологічних рідин.

Хід роботи

На хроматографічному папері олівцем відмічають точки нанесення різних концентрацій амінокислот. Автоматичною мікропіпеткою наносять на папір 1, 2, 3, 4 об'єми 0,01 М розчину амінокислоти, причому кожну наступну порцію розчину наносять після повного висушування паперу. Якщо, наприклад, об'єм мікропіпетки становить 5 мкл, відповідно буде нанесено 5, 10, 15, 20 мкл 0,01 М розчину або 0,05; 0,1; 0,15; 0,20 мкм амінокислоти.

У п'яту точку наносять один об'єм амінокислоти невідомої концентрації. Після нанесення всіх концентрацій амінокислот папір висушують на повітрі.

Потім хроматограму занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 % -м розчином нінгідрину в ацетоні, просушують у витяжній шафі при кімнатній температурі і 15 хв прогрівають для проявлення забарвлення в сушильній шафі або термостаті при 60 °С. Потім вирізають зони хроматограми з яскраво-ліловими плямами амінокислот. Збоку хроматограми вирізають контрольні зони, що дорівнюють за площею дослідним. Вирізані зони паперу подрібнюють ножицями і помішують у пробірки. В кожну пробірку додають 5 мл 0,005 % -го розчину сульфату міді в 75 % -му етиловому спирті. Лілове забарвлення амінокислот переходить в оранжево-червоне внаслідок утворення Cu-похідного ДІДА і відбувається екстракція комплексної сполуки амінокислоти з паперу.

Пробірки на 30-60 хв ставлять у темне місце при кімнатній температурі.

Всі проби фотометрують проти контрольної на ФЕК з зеленим світлофільтром. На основі знайденої оптичної густини і взятих концентрацій будують калібрувальні графіки, де на осі абсцис вказують концентрацію амінокислот у мікромолях, а на осі ординат — оптичну густину.

Знаходять оптичну густину амінокислоти невідомої концентрації і за побудованим графіком визначають її концентрацію,

Реактиви

Суміш розчинників н-бутанол, оцтова кислота, вода в об'ємному співвідношенні 4:1:5 (40 мл н-бутанолу, 10 мл оцтової кислоти, 50 мл води дистильованої протягом 1-2 хв струшують у ділильній воронці. Після розшарування нижній шар зливають, а верхній використовують як рухому фазу).

0,5 % -й розчин нінгідрину в ацетоні (95 частин 0,5 % -го розчину нінгідрину в ацетоні, 1 частина льодяної оцтової кислоти і 4 частини води змішують безпосередньо перед визначенням).

0,005 %-й розчин CuS04 * 5Н20 в 75 %-му етиловому спирті (5 мг сульфату міді розчиняють у 22 мл води і об'єм доводять 96 % -м спиртом до 100 мл).

4о 96 % -й етиловий спирт.

5. Стандартні 0,01 М розчини амінокислот (кількість коленої амінокислоти, що відповідає 0,05 М розчину, зважують на аналітичних терезах і розчиняють в 0,01 н розчині соляної кислоти).

4. Хроматографічний папір.