Самостійна робота студента

• Провести аналіз м’яса (яловичини, свинини та курятини) охолодженого та сумлінної свіжості на загальне мікробне обнасінення.

• Провести аналіз м’яса на наявність умовно-патогенної мікрофлори.

• Провести аналіз мікрофлори повітря.

• Провести аналіз мікрофлори води.

• Визначити колі-тітр.

Матеріали та обладнання:

1. Спиртівка, сірники, бактеріологічна петля, препарувальна голка, піпетка, шпатель Дригальського, мікроскоп, комплект предметних і покривних скелець, стерильні скальпелі, бюкси, пестики, ступки.

2. Поживні середовища: 1 пробірка з МПА, 1 пробірка з МПБ, 2 чашки Петрі з МПА, 1 чашка Петрі на двох з сусло-агаром. Стерильний пісок, стерильна вода.

3. М’ясо: свіже, сумнівної свіжості, зіпсоване.

4. Технічні ваги і набір важелів.

Література: [1] – с.249; [2] – с.5-8; [5] – с.351-370.

Лабороторне заняття №3.

ТЕМА: Мікробіологічний аналіз сировини для ковбасного виробництва.

ПЛАН:

• Методи мікробіологічного аналізу сировини (фаршу, перцю червоного та чорного, кардамону, солі та ін.) для ковбасного виробництва.

• Аналіз сировини та напівфабрикатів ковбасного виробництва.

• Способи визначення видової належності мікроорганізмів.

Мікробіологічний аналіз сировини для ковбасного виробництва

Сировина для ковбасного виробництва

Сировиною для ковбасного виробництва є фарш та домішки, що забезпечують органолептичні характеристики готового продукту та, у деяких випадках, подовжують термін його зберігання. До фаршу додають нітрит натрію (для забарвлення), сіль, перець та інші компоненти згідно рецептури. Відбір проб фаршу проводять один раз на тиждень від кожного виду продукту, а від спецій – середню пробу від кожної партії.

Зразки масою 100-200 г відбирають у стерильних умовах. Кожний із зразків окремо пакують в стерильний пергаментний папір, підписують і направляють в бактеріологічну лабораторію.

При бактеріальних дослідженнях визначають загальну кількість мікроорганізмів в 1 г проби, характер мікрофлори, наявність бактерій групи кишкової палички, протея, анаеробну мікрофлору.

Для визначення загальної кількості мікроорганізмів із приготовленої середньої проби беруть наважку 1-2 г і готують суспензію так само як при дослідженні м’яса. Потім в стерильну чашку Петрі вносять 0,1-0,2 мл, відбираючи їх з верхнього шару суспензії, заливають розтопленим МПА, перемішують вміст чашки і, після того як середовище застигне, вміщують на 18 годин в термостат при 37 ⁰С.

Підрахунок колоній і визначення кількості мікроорганізмів в 1 г продукту виконують по загально прийнятій методиці.

Для визначення характеру мікрофлори 0,1 мл суспензії наносять на поверхню застиглого МПА і рівномірно розподіляють шпателем Дригальського по всій поверхні середовища. Чашки з посівом витримують при 37 ⁰С на протязі 24 годин, після чого роздивляються під лупою.

Колонії, підозрілі на патогенну мікрофлору, вивчають так само, як і при бактеріальному дослідженні м’яса.

• Визначення видової належності мікроорганізмів.

При аналізі мікрофлори м’яса та м’ясних виробів іноді виникає необхідність в ідентифікації виділених культур.

До визначення виду бактерій можна приступити тільки при наявності чистої культури.

Ідентифікацію бактерій проводять по їх культуральним, фізіологічним та морфологічним ознакам.

Морфологічні ознаки.

1. Форма бактерій.

В основному бактерії мають кулькоподібну, паличковидну або звивисту форми. Інколи палички вигнуті. В старих культурах частіше, ніж в молодих, знаходяться палички з заокругленими або загостреними кінцями. Деякі види бактерій гілкуються.

2. Характер розташування бактерій.

Кулькоподібні бактерії можуть бути розташовані окремо, з’єднані по двоє, по чотири, в ланцюжки, в пакети, гроноподібні накопичення. Паличковидні бактерії існують поодиноко, з’єднані попарно або ланцюжком.

3. Розміри бактерій.

Визначаються найбільші і середні розміри.

4. Спороутворення.

Спори можуть утворюватись в центрі клітини, не змінюючи її форм (бацили). У деяких бактерій діаметр клітини менший за діаметр спори (клострідії). Коли спори утворюються субтермінально, паличка приймає форму тенісної ракетки або барабанної палички (плектридії).

5. Рухливість бактерій визначають в препаратах розчавлена крапля і висяча крапля.

6. Наявність капсул встановлюють в не забарвлених та забарвлених препаратах. На відміну від безкапсульних бактерій, капсульні мікроорганізми не доторкаються один до одного, так як капсули заважають їх більш щільному розташуванню. Для забарвлення капсул використовують спиртовий розчин туші.

7. Відношення до фарбування по Граму: (Грам ⁺ чи Грам ^- ).

Культуральні ознаки.

Для визначення культуральних ознак досліджувану чисту культуру засівають на рідкі і щільні живильні середовища. Колонії, які виросли в чашках Петрі на МПА досліджують, визначається їх кількість:

характер росту – скудний, пухкий, однорідний або неоднорідний;

форму – круглі, амебовидні, кореневидні, валковоподібні та інші;

величину – крапкові (діаметром 1 мм), маленькі (1-2 мм), середні (2-4 мм), великі(4-6 мм) і більші;

колір – білі, зелені, жовті, прозорі та інші;

поверхня – матова, блискуча, гладка, плоска, куполоподібна, кругла;

краї – рівні, хвилясті, дольчаті, у вигляді локона, розпливчаті;

консистенцію – маслоподібна, слизиста, в’язка, волокниста, мокра, суха;

структуру – аморфна, зерниста, порошкоподібна, гілкоподібна, сипуча.

При вивченні росту мікроорганізмів на рідких середовищах відмічають:

інтенсивність росту – невелика, помірна, значна;

наявність муті – слабка, помірна, значна, рівномірна, нерівномірна, зерниста, у вигляді пластівців;

характер осаду – невеликий, значний, у вигляді пластівців, в'язкий;

утворення на поверхні середовища пристінного кільця, плівки, шершавої поверхні.

В посівах голкою відмічають:

в МПА – ріст по лінії уколу (ниткою, з боковими отворами або без них ).

В МПЖ – розрідження середовища і його характер (кратероподібний, воронкоподібний, шаровий, у вигляді ялинки і т.д.).

Фізіологічні ознаки.

Фізіологічні ознаки мікроорганізмів обумовлені їх біохімічними особливостями, їх діагностують при посіві на діференцйно - діагностичні живильні середовища. До фізіологічних ознак відносять:

1. Тип живлення мікроорганізмів.

2. Відношення до кисню – аероби, анаероби, облігатні анаероби.

3. Відношення до температури – мезофіли, психрофіли, термофіли.

4. Відношення до рН .

5. Можливість розвитку в молоці.

6. Цукролітичні властивості – здатність розщеплювати цукри.

7. Протеолітичні властивості – здатність розщеплювати білки.

8. Окисно-відновні властивості.

Кожний вид мікроорганізмів виробляє постійний для нього набір ферментів, одні з яких розщеплюють білки і вуглеводи, а інші викликають окислення чи відновлення різноманітних субстратів.

Диференційно-діагностичні середовища, залежно від складу, можна поділити на 4-ри групи:

1. Середовища, які містять білкові речовини (желатину, молоко, сироватку крові у згорнутому вигляді, курячі білки для визначення наявності протеолітичних ферментів).

2. Середовища з цукрами для визначення цукролітичних властивостей.

3. Середовища з хімічними речовинами, які змінюють свої властивості під дією окисно-відновних ферментів.

4. Середовища, які містять індиферентні хімічні складові, що є джерелом живлення одних видів мікроорганізмів і не асимілюються іншими видами.

Визначення протеолітичних властивостей мікроорганізмів

Деякі мікроорганізми в процесі життєдіяльності виділяють протеази, які розщеплюють білки. Наявність протеолітичних ферментів у мікроорганізмів можна визначити при засіві в стовпчик МПЖ.. При температурі 22-23 ⁰С і витримці на протязі 24-48 годин, желатин розріджується, при чому форма цього розрідження різна – шарова, кратероподібна та воронкоподібна.

При засіві на молочний агар Ейкмана в чашку Петрі (10 частин стерильного розплавленого МПА і 3 частини стерильного знятого молока), роблять засів петлею і термостатують при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин. Культури, що виділяють протеолітичні ферменти, викликають пептонізацію казеїну і утворення навколо колоній прозорих зон на мутному фоні середовища. Культури аеробних мікроорганізмів засівають на середовища з сироваткою крові в чашку Петрі, а анаеробних - уколом в стовпчик і витримують при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин. Штами, які продукують протеолітичні ферменти, розріджують живильне середовище і утворюють навколо колоній поглиблення.

Деяким видам патогенних і умовно-патогенних мікроорганізмів властива протеолітична активність. Вони здатні розщеплювати білок до продуктів глибокого розпаду: індолу, сірководню, сечовини, аміаку.

Для диференціації різновидів патогенів найбільше значення має виявлення індолу та сірководню.

Індол утворюється внаслідок розщеплення триптофану. Для встановлення його наявності в пробірку з МПБ або пептонною водою, засіяною досліджуваною культурою, підвішують смужку фільтрувального паперу, який попередньо насичують гарячим розчином щавелєвої кислоти. Якщо після витримки при 37 ⁰С на протязі 24-48 годин папір забарвлюється в рожевий або червоний колір, це свідчить про наявність індолу.

Сірководень - кінцевий продукт розщеплення цистину, цистеїну та метіоніну. Для його виявлення в пробірку з МПБ підвішують висушену смужку фільтрувального паперу, змочену 10%-ним розчином оцтовокислого свинцю. При виділенні сірководню, папір буріє або чорніє (утворюється сірчистий свинець).

Утворення сірководню і індолу, визначають одночасно, для чого в пробірку підвішують два індикатори.

Визначення сахаролітичних властивостей мікроорганізмів

Здатність розщеплювати вуглеводи і багатоатомні спирти, які об’єднують в одну групу цукри, притаманні багатьом умовно-патогенним і патогенним мікроорганізмам.

Під дією сахаролітичних ферментів бактерій, цукри розщеплюються до альдегідів і кислот. Кінцевими продуктами їх розщеплення є вуглекислий газ і водень.

Різні види і штами мікроорганізмів по-різному відносяться до цукрів.

Одні ферментують лактозу, інші - глюкозу, треті- і те і інше.

Цю властивість в мікробіології використовують для розрізнення видів бактерій.

Досліджувану культуру засівають в живильні середовища Гісса, які також називаються строкатим  рядом Гісса, що являють собою ряд пробірок з пептонною водою (1%-пептону), цукрами (0,5-1%), повареною сіллю (0,3%) і індикатором Андрере (1мл індикатора на 100 мл середовища) або бромтимолблау (0,1 мл 1,6%-ного розчину бромтимолблау на 100 мл середовища).

Індикатор Андрере готують таким чином: 0,3 г кислого фуксину розчиняють в 100 мл стерильної дистильованої води і додають 16,4 мл 1 н. розчину їдкого натру. Розчин стерилізують при 100 ⁰С на протязі 5 хв і зберігають в темному місці у флаконі з притертим корком. Індикатор Андрере має солом’яно-жовте забарвлення. При зміщенні рН середовища в кислий бік він набуває яскраво-малинового забарвлення. Індикатор бромтимолблау дозволяє визначити зміну рН в межах 6,0-7,6. В лужній зоні (рН=7,6) індикатор має синій колір, в кислій зоні (рН=6,0) – жовтий. При зміні рН у вказаному діапазоні забарвлення приймає різні відтінки зеленого кольору.

Індикатор бромтимолблау готують так: 0,4 г бромтимолблау розчиняють в 40 мл дистильованої води, нагріваючи її до кипіння. Після цього до розчину додають 6,4 мл 0,1 н. розчину їдкого натру, в результаті чого рідина забарвлюється в зеленуватий колір і доливають дистильованою водою до 100 мл. Індикатор зберігають в темному місці в склянці з притертим корком .

Строкатий  ряд Гіса містить 5 пробірок: з глюкозою, лактозою, манітом, мальтозою і цукрозою. Для поглибленого аналізу строкатий  ряд Гіса доповнюють ще іншими цукрами: дульцитом, сорбітом, ксилозою, арабінозою. Цукор і спирти, які застосовують при приготуванні середовищ, повинні бути хімічно чистими.

Для визначення газоутворення (кінцеві продукти розпаду цукрів) в пробірки з рідкими середовищами Гіса занурюють поплавок (трубка діаметром 0,5-0,7 см, запаяна з одного кінця і перевернута догори дном). При стерилізації він повністю заповнюється живильним середовищем. При виділені газу у поплавку утворюється повітряна бульбашка і поплавок вспливає. Пробірки з набором середовищ Гісса ставлять у штатив у ряд, надписують номер пробірки і який цукор в кожній з них, і засівають досліджуваною культурою за допомогою бактеріологічної петлі. Середовища в штативі витримують в термостаті при 37-43 ⁰С на протязі 48-72 годин. Зміна кольору живильного середовища в пробірці позначають буквою К (кислотоутворення), а кислотоутворення з появою бульбашок газу в поплавці – буквами КГ, де Г вказує на утворення газу.

Визначення окислювально-відновних властивостей мікроорганізмів

Мікроорганізми також продуцюють і окислювально-відновні ферменти. Окислення субстрату може проходити за рахунок приєднання до нього кисню (ферменти оксидаз) або відщеплення водню.

Речовина, від якої відщеплюється водень, називають донором, а до якого приєднується – акцепором. Акцептором водню частіше є кисень повітря, а також багато органічних сполук.

Для виявлення дегідраз і визначення їх активності застосовують метод додавання в живильне середовище органічного барвника, який виконує роль акцептора водню. В результаті приєднання водню барвник відновлюється, перетворюючись в безбарвну сполуку. Останній при контакті з киснем повітря може знову окислитись і набути свій попередній колір. В якості акцепторів водню використовують метиленову синь, лакмусову настоянку, малахітову зелень, та інші.

Окислювально-відновні властивості мікроорганізмів можна встановити при засіві культур на МПБ, МПА, молоко, з додаванням розчинів барвників: на 5 мл середовища 1 краплю 5%-ного розчину метиленової сині, або 1-2 краплі 5%-ного розчину індигокарміну, або 1 краплю лакмусової настоянки. При позитивній реакції середовище повністю втратить забарвлення.

Відношення мікроорганізмів до кисню повітря

Для визначення відношення мікроорганізмів до кисню проводять засів проби уколом в стовпчик МПА з послідуючою 48-годинною витримкою при температурі 30-37 ⁰С.

Якщо спостерігається ріст мікроорганізмів на поверхні середовища у вигляді цвяха шляпкою догори;- то це аероби. Незначний ріст на поверхні і більш інтенсивний по всій довжині уколу є характерним для факультативних анаеробів. Активне розрідження середовища на дні пробірки характеризує розвиток облігатних анаеробів.

Матеріали дослідів по визначенню виду мікроорганізмів заносять в таблицю 7.3.

На основі отриманих даних встановлюють родину і вид досліджуваних мікроорганізмів по спеціальним визначникам.

Приклад :

Земляна паличка (Bac. Mycoides) - аеробні бацили розміром 5-7 х 0,8-1,2 мкм, поодинокі або у вигляді ланцюжків, рухливі, Грам⁺, капсул не утворюють, здатні до спороутворення. На МПА ростуть як пухнасті, міцелевидні, лежачі по поверхні середовища колоній. На МПБ утворюють зморшкувату плівку. МПЖ розріджують у вигляді кратера. Молоко не згортають. Розкладають глюкозу і цукрозу з утворенням кислоти і газу. “

“Строкатий” ряд Гіса (приклад)
Цукроза		Лактоза		Мальтоза			Глюкоза			Манніт
К	Г	К	Г	К	Г	К		Г	К		Г
+	+	-	-	-	-	+		+	-		-

Пігментні бактерії (Pseudomonas fluоrescens) маленька без спорова паличка, рухлива (лофотрихії), Грам^-. Утворює зеленувато-жовтий флюоресцируючий пігмент.

Пігментна бактерія чудова паличка (Bact. prodigiosum) - також мала (1-2 х 0,6 мкм), без спорова паличка, рухлива (перитрихії), Грам^-, капсул не утворює.

На МПА ростуть колонії темно-червоного кольору з металевим блиском. На МПЖ росте у вигляді воронки. Молоко згортає, в МПБ утворює змутнення.

Характеристики окремих видів сапрофілів

Bact. proteus vulgaris (паличка протея)- прямі, поліморфні палички розміром 1,5-2 х 0,5-0,8 мкм. Типовийсапрофіт. Зустрічається на м’ясі, в кишечнику тварин та людей, у воді, грунті і т.п.

Характеристика чистої культури

Характеристика колоній

Характеристика мікроорганізму

МПА сто

Розмір

Форма

Край

Поверхня

Блиск

Колір

Форма

Розмір

Рухливість

Спороутворення

Касулоутворення

Фарбування по Граму

Аероб

Анаероб

Факультативний аероб

МПЖ

Лакмусове молоко

Середовища Ейкмана

Середовища Гісса

Без розрідження

Розрідження

Кисла

Лужна

Обезбарвленна

Освітлена

Не освітлена

Цукроза

Лактоза

Мальтоза

Глюкоза

Манпіт

Спори і капсули не утворюють, Грам ^- .

Активний рух клітин (перитрихії)надає колоніям на твердих середовищах характерну особливість, що обумовлена виходом із колонії окремих клітин і скупчення їх на поверхні субстрату. Утворюється багато мілких, ледве помітних блідих колоній.

Бактерії розкладають білки з утворенням індола і сірководню, розсщеплюють вуглеводні середовища з утворенням вуглекислого газу і води. Оптимальна температура для росту паличок протея 25-37 ⁰С. При 5 ⁰С ріст зупиняється.

Escherichia coli, Bact. coli (кишкова паличка) – прямі, із заокругленими кінцями, поліморфні палички розміром 2,5-3 х 0,5-0,8 мкм. Зустрічаються рухливі і нерухливі форми .Спор не утворюють. Деякі види мають капсулу, Грам ^-.

На твердих середовищах утворюють брудно-білі, гладенькі, блискучі, ледве випуклі або плоскі колонії, а на середовищі Ендо-характерні випуклі яскраво-червоні колонії з металевим блиском. Кишкова паличка є типовим сапрофітом. Зброджує глюкозу, лактозу, мальтозу, згортує молоко, розкладає білки з утворенням індолу та сірководню.

Clostridium putrificum - великі палички із прямими кінцями (5-9 х 0,4-0,8 мкм), з’єднані в ланцюги або поодинокі, рухомі.

Утворюють кулеподібні термінально розміщені спори, капсул не утворюють, Грам ^-. Спори термостійкі.

На МПА ростуть у вигляді корневидних, рихлих колоній. Не мають цукролітичних і властивостей.

Зустрічаються в грунті, в їжі, в ротовій порожнечі, в кишечнику тварин, на продуктах, іноді в консервах. В анаеробних умовах викликають розкладання білкових речовин з виділенням газів - аміаку і сірководню. В консервах при зберіганні можуть розвиватися і визивати мікробіологічний бомбаж.

Clostridium sporogenes -великі палички із заокругленими кінцями (3-7 х 0,8-1,1 мкм), рухомі, утворюють субтермінальні спори овальної форми, капсул не утворюють, Грам ⁺.

На МПА в анаеробних умовах утворюють міленьки, не правильної форми, спочатку прозорі, а потім жовто-білі колонії.

В МПБ викликають помутніння, газоутворення і появу неприємного запаху. Здібні розчеплювати білок до кінцевих продуктів, розріджувати желатин,розкладати цукри. На печінкових середовищах утворюють чорний пігмент.

Спори термостійки - витримують прогрів при 100 ⁰С на протязі 2 годин. Після стерилізації проростають і можуть зіпсовувати консерви.

Це головний збудник процесів гниття у м’ясі і м’ясопродуктах.

САМОСТІЙНА РОБОТА СТУДЕНТІВ:

• Провести мікробіологічний аналіз м’яса (закінчення).

• Визначити загальну мікробну обнасіненність сировини для ковбасного виробництва.

• Провести аналіз сировини на присутність умовно-патогенної мікрофлори.

Можливо виготовлення фаршу в лабораторних умовах.

Література: [1] – с.255-257; [2] – с.8-10; [5] – с.427-482.