Created for http://www.uapf.com.ua

2.7. Біологічні методи кількісного визначення

прспарат>- в певних умовах індукувати утворення специфічних антитіл проти поверхневого антигена (HBsAg) гепатиту В у мишей або мурчаків, або in vitro імунохімічним визначенням вмісту антигена.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ IN VIVO

Вибір і розподіл випробовуванихтварин. У випробуванні використовують здорових мишей одного приплоду близько п'ятитижнєвого віку. Лінія мишей, використовувана для цього випробування, має давати значний нахил у кривій доза-відповідь до антигена: придатними є миші з гаплотипом Н-2С або H-2d. Здорові мурчаки одного приплоду масою від 300 г до 500 г (близько семитижневого віку) також вважаються придатними для випробування. Використовують тварин однієї статі. Тварин нарівно розподіляють у 7 груп, кількість тварин в яких відповідає вимогам випробування.

Визначення активності випробовуваної вакцини. Використовуючи розчин 9 г/л натрію хлориду Р, до складу якого входить ад'ювант, що містить алюміній, використаний у вакцині, готують не менше 3 розведень випробовуваної вакцини і відповідні розведення стандартного препарату. За кожною групою тварин закріплюють по одному розведенню і кожній тварині групи підшкірно вводять не більше 1.0 мл відповідного розведення. Одну групу тварин використовують як невакцинований контроль і кожній тварині цієї групи внутрішньочеревно вводять таку саму кількість розчинника. Після відповідного інтервалу часу (наприклад, від 4 до 6 тижнів) проводять анестезію тварин і їх знекровлення, одержуючи індивідуальну сироватку від кожної тварини. У кожній індивідуальній сироватці підхожим імунохімічним методом (2.7.1) кількісно визначають специфічні антитіла до HBsAg.

Розрахунки. Розрахунок проводять звичайними статистичними методами для кількісного визначення з використанням методу пробітів (5.3).

Із розподілу рівнів реакцій, виміряних у всіх сироватках невакцинованої групи, визначають рівень максимальної реакції, яку можна очікувати у невакцинованої групи для даного конкретного випробування. Будь-яка відповідь вакцинованих тварин, що перевищує цей рівень, указує на сероконверсію.

Проводять підхоже перетворення відсотка тварин, що проявляють сероконверсію в кожній групі (наприклад, пробіт трансформацію), й аналізують результати відповідно до моделі паралельних ліній для log доза-відповідь. Визначають активність випробовуваного препарату відносно стандартного препарату.

Умови придатності. Результати випробування вважаються невірогідними, якщо:

—ED5() для випробовуваної і стандартної вакцин не знаходиться між найменшою і найбільшою дозою, отриманою твариною;

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

—статистичний аналіз показує значні відхилення від лінійності або паралельності;

—довірчий інтервал (Р=0.95) менше 33 % і більше 300 % від установленої активності.

Вимоги до активності. Верхній довірчий інтервал (Р=0.95) установленої відносної активності складає не менше 1.0.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ IN VITRO

Проводять імунохімічне визначення (2.7.1) вмісту антигена з валідованими критеріями прийнятності відносно in vivo випробування.

Показано, що за підхожі методи можна вважати радіоімуноаналіз (РІА, RIA) й імуноферментний аналіз (ІФА, ELISA), з використанням специфічних для індукуючих захисні епітопи HBsAg моноклональних антитіл. Використовують підхожу кількість розведень випробовуваної вакцини і стандартного препарату і застосовують модель паралельних ліній для аналізу результатів, які можуть бути відповідним чином перетворені. Комерційно доступні набори для вимірювання HBsAg in vitro, і можлива їх адаптація для застосування в in vitro кількісному визначенні активності.

Компетентний уповноважений орган затверджує критерії прийнятності для даного стандартного препарату, виходячи з результатів валідації.

БСП вакцини для профілактики гепатиту В (рДНК) методомА і БСП вакцини для профілактики гепатиту В (рДНК) методом 5 придатні для in vitro кількісного визначення певних вакцин, зазначених у супровідній документації БСП.

2.7.24. ПРОТОЧНА ЦИТОМЕТРІЯ

Проточна цитометрія складається із мультипараметричного аналізу оптичних властивостей окремих частинок у рідинній системі.

Клітини або частинки в суспензії поодинці розподіляються у лінійному потоці та проходять через детектор. Тверді тканини для аналізу слід подрібнити до суспензії окремих клітин.

Спектр параметрів, вимірюваних проточною цитометрією, включає: об'єм і морфологічну складність клітин або структур, схожих на клітини; клітинні пігменти; вміст ДНК, РНК і білків; клітинні поверхневі маркери; внутрішньоклітинні маркери; ферментативну активність; рН; мембрани і плинність.

Можна одержувати два морфологічні параметри та один або більше флуоресцентні сигнали від однієї клітини. Мультипараметричний аналіздозволяє визначити клітинні популяції за їх фенотипом.

135

Created for http://www.uapf.com.ua

2.7. Біологічні методи кількісного визначення

ОБЛАДНАННЯ

Фокусування, збільшення і вибір джерела світла огттимізовані. що дозволяє автоматично визначати і вимірювати морфологічні відмінності та забарвлення зразка. Аналіз проточкою цитомєтрією має витримувати такі критерії:

—вибір джерела світла залежить від аналізованих параметрів:

—регулювання настроювань інструмента залежить від типу аналізованих клітин (наприклад, культура клітин, лейкоцити, тромбоцити, бактерії, сперматозоїди, дріжджі) і аналізу, шо проводиться (наприклад, фенотипування, клітинний цикл, апоттгоз. цитокіни. плинність мембран, флуоресцентний білок).

Проточна цитометрія характеризується автоматичним кількісним визначенням набору параметрів для великої кількості одиничних клітин при кожному аналізі. Наприклад, 100 000 частинок або більше (практично необмежена кількість) звичайно аналізуються по черзі приблизно за 1 хв. Межа детекції складає менше 100 флуоресцентних молекул на клітину.

Прилад проточного цитометра складається із 5 основних компонентів:

—рідинна система та проточна кювета:

—джерело світла;

—система детектора й аналогово-цифрового перетворювача (АЦП, ADC);

—система підсилення;

—комп'ютер із програмним забезпеченням для аналізу сигналів.

РІДИННА СИСТЕМА ТА ПРОТОЧНА КЮВЕТА

Кожна клітина піддається дії джерела світла і детектується у проточній кюветі. Рідинна система переносить суспендовані окремі клітини поодинокі з пробовідбірника до лазерного відсіку. Для цього потік зразка рідким струменем у проточній кюветі витягується в дуже тонку рідку нитку (гідродинамічне фокусування). Промінь світла фокусується в еліпсоїдну форму двох кофокусних лінз у канал проточної кювети, через яку проходять клітини. Швидкість потоку має бути стабільною в процесі рутинного аналізу клітинних поверхневих маркерів і має забезпечувати підхожу відстань між клітинами для їх підрахунку.

ДЖЕРЕЛА СВІТЛА

Звичайно використовують такі джерела світла:

—лампи (ртутні, ксенонові);

—потужні охолоджувані водою лазери (аргонові, криптонові, лазер на барвнику);

—малопотужні охолоджувані водою лазери (аргоновий (48S нм). червоний гелій-неоновий (633 нм). зелений гелій-неоновий. ге.лійкадмієвий (УФ));

І 38

—діодні лазери (блакитний, зелений, червоний, фіолетовий).

ДЕТЕКЩЯ СИГНАЛУ

Коли частинка проходить через пучок світла, частина світла розсіюється на всі боки. Додані до частинок флуоресцентні барвники мають власне випромінювання (флуоресценція), яке також розсіюється на всі боки. Тому можуть утворюватися 2 типи сигналів:

—розсіювання світла;

—флуоресцентна емісія.

Світлові детектори приладу вловлюють частину розсіювання і флуоресцентного випромінювання і перетворюють на електронні сигнали пропорційно кількості вловленого світла.

Розсіювання. Вимірюють 2 параметри світлорозсіювання:

—кількість, в основному розсіяна вперед (пряме розсіювання (FS));

—кількість, розсіяна у напрямі 90° від напряму пучка світла (бічне розсіювання (SS)).

Пряме розсіювання корелює з об'ємом клітин, тоді як на бічне розсіювання впливають такі параметри, як форма ядра, кількість і тип цитоплазматичних іранул або шорсткість мембран, і SS корелює з морфологічною складністю клітин: чим вища інтенсивність SS, тим складніша клітина. Як функція морфологічних характеристик клітин сигнали розсіювання завжди генеруються в ході проточних аналізів: вони називаються «внутрішніми параметрами».

Флуоресиеншя. Залежно від типу і кількості джерел світла при проходженні клітин через сенсорні зони вони випромінюють флуоресцентне світло. Флуоресцентні сигнали утворюють природні флуоресцентні барвники, присутні в клітинах (наприклад, коферменти, хлорофіл, пігменти морських водоростей), і/або флуоресцентні зонди, вставлені в клітини при забарвленні для аналізу специфічних характеристик (наприклад, флуоресцентні антитіла, барвники нуклеїнових кислот, рН-зонди. кальцієві зонди, флуоресцентні білки). У наш час доступна велика кількість і широка різноманітність різних типів флуоресцентних зондів. Оптичні фільтри мають бути адаптовані до використовуваних флуорохромів і замінюватися, якщо це необхідно. Кожен флуоресцентний зонд характеризується своїми спектрами збудження та емісії. їх вибирають залежно від типу джерела збудження і системи детекції відповідно до специфічної мети аналізу.

УПРАВЛІННЯ СИГНАЛОМ І А НАЛОГОВОЦИФРОВИЙ ПЕРЕТВОРЮВА Ч

Сигнали розсіювання і флуоресценції, що випромінюються клітинами при їх проходженні через лазерний пучок, сортуються і прямують до своїх детекторів, використовуючи оптичні фільтри. Де-

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4 135

Created for http://www.uapf.com.ua

2.7. Біологічні методи кількісного визначення

тектори — це датчики (фотопомножуючі трубки (ФПТ (PMTs)). які перетворюють випромінюваний клітинами світловий сигнал на імпульси напруги.

Процес підрахунку кожного імпульсу у відповідному канаті проводить аналогово-цифровий перетворювач (АЦП). У результаті процес подається як частотна гістограма.

Підсилення. Імпульси напруги вимагають підсилення для оптимальноївізуалізації. Процес підсилення акцентує відмінності між клітинними сигналами і, отже, збільшує розділення серед популяції клітин із різними характеристиками (наприклад, диференціація життєздатних і нежиттєздатних клітин або неспецифічної флуоресценції від антиген-спедафічної флуоресценції після забарвлення флуоресцентними моноклональними антитілами).

Існують 2 методи підсилення—лінійне і логарифмічне. Вибір між двома типами проводять для кожного одиничного сигналу, залежно від морфологічних властивостей клітин і використаних реактивів для забарвлення (наприклад, флуоресцентні моноклональні антитіла, барвники нуклеїнових кислот).

Лінійне підсилення, яке збільшує відмінності серед сильних імпульсів, використовується із тими параметрами, які генерують сигнали з високою інтенсивністю, наприклад:

—розсіювачі клітин;

—флуоресценція від барвників нуклеїнових кислот, використовуваних при вивченні клітинних циклів.

Логарифмічне підсилення, на відміну від попереднього типу, використовують для слабких імпульсів і параметрів або аналізів станів, які можуть утворити як слабкі, так і сильні імпульси, наприклад:

—клітинні антигени;

—розсіювання від тромбоцитів, бактерій, дріжджів;

—флуоресценція від барвників нуклеїнових кислот для вивчення апоптозів.

Компенсація флуоресцентних сигналів. Кожен флуоресцентний барвник має спектр довжин хвилі абсорбції і більший — випромінювання (емісії). При використанні для забарвлення клітин одночасно 2 або більше флуоресцентних зондів (наприклад, 4-антиген імунофенотипування) спектри випромінювання флуорохромів можуть перекриватися. Згодом кожен флуоресцентний детектор реєструватиме своє специфічне флуоресцентне випромінювання і варіабельну кількість випромінювання інших флуоресцентних зондів. Це призводить до переоцінки сигналу і поганого розділення клітинної популяції.

Рішення полягає у використанні електронної матриці, що дозволяє селективно розмежовувати взаємодіючі сигнали від кожного флуоресцентного сигналу після реєстрації детектором (компенсація флуоресценції).

І38ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4

Компенсація флуоресценції вимагає застосування флуоресцентних калібраторів; перевага надається позитивним клітинним зразкам, забарвленим відповідним флуорохромом, комбінованим з антитілами, що використовуються д ля аналізу.

ГРАФІЧНЕ ЗОБРАЖЕННЯ ІВІЗУАЛІЗАЩЯ СИГНАЛУ

Після підсилення і компенсації сигнали подаються v вигляді 2- або 3-мірних графіків. Гістограми показують інтенсивність сигналу відносно кількості клітин для зазначеного параметра. Цитограми, в яких кожна точка представляє одну клітину, є результатом комбінації двох сигналів (двопараметричні діаграми (дот-плоти)). Тип і кількість графіків і комбінацій сигналів вибирають на основі використаних зразків і барвників. При аналізі отриманих результатів програмним забезпеченням проточного цитометра можуть бути подані й інші види графіків (такі як накладки зображень, графічні тривимірні зображення, томограми, контурні зображення, графіки густини). Також можуть використовуватися статистичні результати, такі як середні флуоресцентні інтенсивності (та їх зміна в часі або їх залежність від функцій клітин).

АНАЛІЗ РЕЗУЛЬТА TIB

У випробовуваних клітинних суспензіях можуть бути присутні різні клітинні популяції, деякі з яких небажані (такі як неживі клітини, уламки клітин або макроаірегати) або просто непридатні для аналізу (наприклад, гранулоцити при дослідженні лімфоцитів). Це залежить від типу клітинних зразків (цільна кров, кістковий мозок, культури клітин, біологічні рідини, клітинні суспензії із твердих тканин) і методик їх обробки (наприклад, методи забаралення. лізис, фіксація, кріозбереження, розморожування, залиті у парафін препарати тканин).

Як наслідок, не всі сигнали, що генеруються в процесі аналізу проточною цитометрією, належать клітинам, що вивчаються. Прийняті 2 стратегії з виключення небажаних і невідповідних клітинних сигналів.

Перша стратегія використовується при отриманні даних. Це шумовий поріг, який застосовується до одного (або більше) значущого параметра (параметрів), встановлений для виявлення лише тих клітин, інтенсивність сигналів яких вища, ніж заздалегідь визначена роздільна здатність для даного параметра. Завдяки своєму характерному сильному сигналу з низьким ступенем взаємодії найчастіше як дискримінатор використовують параметр прямого розсіювання.

Друга стратегія використовується при аналізі результатів і полягає у використанні регіонів для обмеження лише тих сигналів від популяцій, які задовольняють вимоги за певними морфологічними

135

Created for http://www.uapf.com.ua

2.7. Біологічні методи кількісного визначення

і експрссійчими характеристиками. Звичайно використов\ють два типи логічних обмежень (гейтування\ Перший — морфологічні обмеження (гейт). Клітинні популяції ідентифікують. використовуючи їх морфологічні сигнали (FS і SS). Гейт регіону встановлюють навколо потрібної популяції (наприклад, лімфоцити, життєздатні клітини), після чого флуоресцентні графіки відображають вибраний регіон. Др>тий — гейт. заснований на флуоресценції. Потрібну клітинну популяцію ідентифікують на основі інтенсивності експресії антигена або барвника, навколо цього встановлюють обмеження регіону. Після цього флуоресцентні графіки обмежуються вибраним регіоном.

Програмне забезпечення аналізу дозволяє створити безліч гейтованих регіонів, використовуючи послідовний логічний порядок. Ця властивість особливо корисна при вивченні рідкісних клітинних популяцій або при сортуванні.

КОНТРОЛІ

Внутрішній контроль. Перед аналізом настроювання оптичної системи має бути валідоване з використанням підхожих флуоросфер і має бути перевірена оптимальна стабільність рідини. Отримані дані реєструють і періодично звіряють контрольні значення з середніми значеннями вїдтворюваності. Дуже актуальним є позитивний контроль для доказу того, шо випробовувані антитіла функціональні та дозволяють відповідним чином налагодити проточний флуориметр. Позитивний контроль має включати зразки, які є позитивними маркерами для випробовуваного зразка.

Зовнішній контроль. Для гарантії надійності одержаних результатів або перевірки міжлабораторної відтворюваності рекомендується участь у дослідженнях з професійного тестування.

2.7.27.ЗНАЧЕННЯ ФЛОКУЛЯЦІЇ (Lf) ДИФТЕРІЙНОГО, ПРОТИПРАВЦЕВОГО ТОКСИНІВ ТА АНАТОКСИНІВ (КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ЗА РАМОНОМ/ПРОБА РАМОНА)

За допомогою методу кількісного визначення за Рамоном (проба Рамона) вміст токсину або анатоксину в зразку може бути виражений значенням флокуляції (Lf). Для випробування в ряд пробірок, що містять певну кількість токсину або анатоксину, по зростаючій концентрації додають антитоксин (сироватку). У точці еквівалентності токсину/анатоксину та антитоксину відбувається флокуляція в одній або декількох пробірках. Першу пробірку, в якій відбулася флокуляція, використовують для визначення значення Lf випробовуваного зразка.

Значення Lf токсину або анатоксину визначається кількістю одиниць антитоксину, яка при змішуванні зі зразком призводить до створення оптимально флокулюючої суміші (проба Рамона).

І 38

Досвід показав, шо результати калібрування антитоксинів у Міжнародних одиницях (МО), наприклад, за міжнародними стандартними антитоксинами. з&тєжать від використаного імунохімічного методу. Тому антитоксини, що використовуються для проби Рамона, мають бути калібровані за міжнародними біологічними стандартними препаратами для тесту на флокуляцію дифтерійного або протиправцевого анатоксину. використовуючи принципи, наведені нижче. Таким чином, концентрація може бути вказана в еквівалентах Lf на мілілітр (Lf-єкв/ мл).

Одна одиниця Lf — це кількість токсину або анатоксину, яка в найкоротший час флокулює з Lf-екв специфічного антитоксину.

У пробірки (наприклад, розміром (7х 1) см) для флокуляції додають різні об'єми розчину 100 Lf-екв./мл стандартного препарату антитоксину. У кожну пробірку додають таку кількість розчину 9 r/л натрію хлориду Р, щоб отримати однаковий об'єм у всіх пробірках, наприклад, 1 мл. Випробовуваний зразок розводять для отримання очікуваної концентрації близько 50 Lf/мл та, наприклад, 1 мл аліквоти розведених зразків додають у кожну пробірку з антитоксином. Вміст пробірок ретельно перемішують струшуванням. Потім вміщують у водяну баню з постійною температурою від 30 °С до 52 °С. Через регулярний проміжок часу розглядають їх на виявлення перших ознак флокуляції. Для цього може бути потрібна лупа та сильне освітлення.

Позначають першу та другу пробірки зі сумішшю, в яких з'явилася флокуляція, та час, необхідний для цього. Флокуляція в двох пробірках може відбуватися одночасно.

Першою пробіркою, в якій відбулася флокуляція, вважається та, яка містить кількість антитоксину, найбільш близьку еквівалентній кількості антигена зразка. Вміст антитоксину в цій пробірці може бути використаний для розрахунку значення Lf зразка. Якщо флокуляція відбувається одночасно в двох пробірках, як результат випробування беруть їх середнє значення.

Час, необхідний для флокуляції у першій пробірці (Kf), є корисним індикатором якості антигена. Якщо при даній температурі та концентрації анатоксину та антитоксину значення Kf більше, ніж в нормі, це вказує на псування антигена. Значення Kf також змінюється в залежності від якості використаного антитоксину.

	Наприклад
	Пробірка	А	В	С	D	Е	F
	Доданий антитоксин	40	45	50	55	; 60	65
	(Lf-екв)

Доданий антитоксин (млV 0.40 0.45; 0.50 0.55 0.60' 0.65

	Доданий розчин (мл)	0.60 0.55 0.50 0.45 0.40:0.35
І	Доданий розведений	1 0	{ 0 1 0 ! 0 1 0 1 0
	зразок	_	'

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ і .4 135

Created for http://www.uapf.com.ua

2.7. Біологічні методи кількісного визначення

Якщо вданому прикладі першою пробіркою, в якій відбулася флокуляція, є пробірка С, то значення Lf розведеної проби становить 50 Lf/мл. Однак, якщо першими пробірками, в яких відбулася флокуляція, є пробірки А та F, це не вказує на еквівалентний рівень. Необхідно провести повторне випробування або з іншим розведенням випробовуваного зразка, або підібрати інший діапазон доз стандартного антитоксину.

Більшої точності можна досягнути введенням запасу послідовностей флокуляції після першої пробірки. Так, у наведеному прикладі, якщо другою пробіркою. в якій відбулася флокуляція, є пробірка D, то кінцеве значення розведеної проби буде 52. У той час, якщо першою пробіркою, в якій відбулася флокуляція, була пробірка В, кінцеве значення буде 48. Випробування може проводитися вдвох паралелях з трохи іншим розведенням випробовуваної проби.

Якщо немає вказівок про очікуване значення Lf випробовуваної проби, рекомендується до проведення кінцевого випробування провести грубу оцінку з більш широким діапазоном вмісту антитоксину в пробірках.

Наприклад
Пробірка	А	В	с	D	Е	F
Вміст антитоксину (Lf-екв) | 20		зо	45	70	100	150

Вміст токсину або анатоксину та концентрацію антитоксину у випробуванні можна варіювати, але не значно впливає на час флокуляції. Так, для низьких концентрацій випробування надто затягнеться, втой час як для високих концентрацій флокуляція пройде дуже швидко і будескладно відрізнити першу та другу пробірки, в яких відбувається флокуляція.

Аналіз низьких концентрацій методом флокуляції суміші

Для дуже низьких концентрацій токсину або анатоксину перевагу вимірювання потрібно надавати методу флокуляції суміші. Це включає порівняння значення Lf відомого токсину або анатоксину з Lf суміші випробовуваного зразка з цим токсином або анатоксином.

Якшо проводять спільну флокуляцію для однорідних токсину або анатоксину з відомим значенням Lf та невідомим значенням Lf, суміш флокулює як сума їх значень. Якщо змішують неоднородні токсини або анатоксини, вони дадуть змішену від норми криву з двома максимумами (піками).

147