Created for http://www.uapf.com.ua

Інсулін л ю д с ь к и й

ІНСУЛІН ЛЮДСЬКИЙ

Insulinum humanum

RYSULLX		HUMAN
J		,
	H - Gtv - Ne - Val - Glu - Gin - Cys - Cys - Thr - Ser - lie -
	і'	I	1<>
	Cvs - SerLeu -Tvr - Gin - Leu - Gfu - Asn - Tvr - Cys -
		"	2 0 i

Залишкові білки клітиии-хазяїнз. Межі встановлюються компетентним уповноваженим органом.

Одноланцгоговий попередник. Межі встановлюються компетентним уповноваженим органом. Використовують метод із підхожою чутливістю.

ВЛАСТИВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору.

A s n - O H

		Розчинність. Практично не розчинний у воді Р та
	H - Phe - Val - Asn - Gin - His - Leu - Cys - Gly - Ser - His -	96 % спирті Р. Розчиняється у розведених міне-
	Leu-Val - Glu - Ala - Leu - Tyr - Leu - Val - Cys - G ^ -	ральних кислотах і із розкладанням у розведених
		розчинах гідроксидів лужних металів.
	Glu - Arg - Gly - Phe -Phe - Tyr - Thr - Pro - Lys - "H>r - OH

C^H^N^O-S*

М.м. 5808

Інсулін людський є дволаншоговим пептидом, який має структуру антидіабетичного гормону, що продукується підшлунковою залозою людини.

Вміст: від 95.0 % до 105 % інсуліну людського ^ - 2 5 7 ^ 3 5 j N 6 5 0 7 7 S 6 у сумі із А 2 1 дезамідоінсуліном людським, у перерахунку на суху речовину.

Умовно, для маркування препаратів інсуліну, приймають, що 0.0347 мг інсуліну людського відповідає 1 МО інсуліну.

ВИРОБНИЦТВО

Інсулін людський одержують ферментативною модифікацією та відповідним очищенням інсуліну із підшлункових залоз свиней або за допомогою технології рекомбінантної ДНК (р-ДНК).

Інсулін людський одержують за умов, що мінімізують ризик мікробіологічного забруднення.

Де застосовно, тварини, від яких одержують інсулін людський, мають витримувати вимоги щодо здоров'я тварин, яких використовують для споживання людиною.

Для інсуліну людського, одержаного ферментативною модифікацією інсуліну із підшлункових залоз свиней, процес виробництва має бути валідованим, щоб продемонструвати, що будь-яка остаточна протеолітична активність виключена. Компетентний уповноважений орган може затребувати додаткові випробування.

Для інсуліну людського, одержаного за допомогою технології рекомбінантної ДНК (р-ДНК), попередньо для кожної серії кінцевого нерозфасованого продукту проводять наведені нижче випробування. Дані випробування не проводять, якщо відповідність даному випробуванню гарантовано компетентним уповноваженим органом.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

A. Переглядають хроматограму, одержану у випробувані «Кількісне визначення».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчину час утримування основного піка має співпадати із часом утримування основного піка на хроматограмі розчину порівняння (а).

B. Пептидне картування (2.2.55).

СЕЛЕКТИВНИЙ РОЗРИВ ПЕПТИЖНИХ ЗВ 'ЯЗКІВ

Випробовуваний розчин. Готують розчин 2.0 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої, 500 мкл одержаного розчину переносять у чисту пробірку і додають 2.0 мл

HEPES буферного розчину рН 7.5 Рї 400 мкл розчину 1 мг/мл протеази Staphylococcus aureus штам V8, тип XVII-B Р. Пробірку закривають та інкубують при температурі 25 °С протягом 6 год. Реакцію зупиняють додаванням 2.9 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р.

Розчин порівняння. Готують аналогічно випробовуваному розчину, замість випробовуваної субстанції додають ФСЗ інсуліну людського.

ХРОМАТОГРАФІЧНЕ РОЗЛІЛЕННЯ. Рідинна хроматогра-

фія (2.2.29).

Колонка:

— розмір: 0.10 м х 4.6 мм.

—	нерухома фаза: сшйкагель октадецигсишьний д.ія
	хроматографії	Р (3 мкм) із розміром nop 8 нм.
—	температура:	40 °С.

Рухома фаза:

—рухома фаза А: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р. 700 мл води Р і 100 мл ацетонітрилу для хроматографії Р: фільтрують і дегазують;

416	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОП ЕЯ УКРАЇНИ і .4

Created for http://www.uapf.com.ua

—pyxo.ua фаза В: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 400 мл води Р, 400 мл ацетонітршіу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

Час (хв)	Рухома фаза А	Рухома фаза В	\
	(% об/об)	(% об/об)
0-60	90 -> ЗО	10-» 70	і
60-65	30-*0	70-> 100
65-70	0	100

Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 214 нм.

Урівноваження колонки: не менше 15 хв за вихідних умов. Хроматограму холостого розчину одержують, використовуючи наведений вище градієнт.

Об'єм інжекції: 50 мкл.

Придатність хроматографічної системи:

—хроматоірами випробовуваного розчину та розчину порівняння мають співпадати із хроматограмою інсуліну людського, що додається до

ФСЗ інсуліну людського,

—на хроматограмі розчину порівняння ідентифікують піки, що відповідають фрагментам I, II і III:

—коефіцієнт симетрії: не більше 1.5 для піків, що відповідають фрагментам II і III,

—коефіцієнт розділення: не менше 3.4 для піків, що відповідають фрагментам II і III.

Результати: хроматографічний профіль випробовуваного розчину має відповідати хроматографічному профілю розчину порівняння.

ПРИМІТКА : часутримування фрагмента І однаковий для інсуліну свинячого та для інсуліну людського. Часи утримування фрагментів Пі IVоднакові для всіх інсулінів. Час утримування фрагмента III однаковий для інсуліну бичачого та для інсуліну свинячого.

ВИПРОБУВАННЯ

Домішки із молекулярною масою, більшою за молекулярну масу інсуліну. Ексклюзивна хроматографія (2.2.30). Використовують метод внутрішньої нормалізації.

Випробовуваний розчин. Готують розчин, що містить 4 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 Мрозчині килоти хлористоводневої.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. Використовують розчин інсуліну (близько 4 мг/мл), шо містить більше 0.4 % високомолекулярних білків. Можуть буги використані лікарські засоби інсуліну для ін'єкцій, такі як розчин або суснсн'іія, освітлені певною кількістю 6 М розчину кислоти хлористоводневої, що містять визначений відсотковий вміст високомолекулярних білків, або розчин субстанції інсуліну в 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої. Інсулін, що містить визначений

Інсулін людський

відсотковий вміст високомолекулярних білків, може бути приготований із субстанції інсуліну, витриманої при кімнатній температурі протягом 10 діб.

Розчини зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 7 діб. Якщо використовують автоматичний інжектор, розчини зберігають при температурі (2-8) °С.

Колонка:

—розмір: 0.3 м х 7.5 мм,

—нерухома фаза: силікагель гідрофільний для хроматографії Р (5-10 мкм) із розміром nop (1212.5) нм, підхожий для розділення мономерів інсуліну від димерів і полімерів.

Рухома фаза: кислота оцтова льодяна Р - ацетонітрил Р - розчин 1.0 г/л аргініну і5 (15:20:65). Одержану суміш фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 0.5 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 276 нм.

Урівноваження колонки: нову колонку перед використанням врівноважують шляхом повторного хроматографування розчину інсуліну, що містить високомолекулярні протеїни. Для цього розчин для перевірки придатності хроматографічної системи хроматографують не менше 3 разів. Колонка вважається врівноваженою, якщо для двох послідовних інжекцій одержано однакові результати.

Об'єм інжекції: 100 мкл.

Час хроматографування: близько 35 хв.

Часи утримування: полімерні комплекси інсуліну— (13-17) хв, ковалентний димер інсуліну - близько 17.5 хв; мономер інсуліну — близько 20 хв, солі - близько 22 хв.

Придатність хроматографічної системи:розчин для перевірки придатності хроматографічної системи:

—хроматографічна система вважається придатною,

якщо відношення Нр до #v становить не менше 2.0, де Н? — висота піка димеру над базовою лінією, Д,—висота над базовою лінією найнижчої точки хроматограми між піком димеру і піком мономеру.

Нормування: сума площ піків із часом утримування меншим ніж час утримування основного піка становить не більше 1.0 % суми площ піків. Не враховують піки із часом утримування більшим, ніж час утримування піка інсуліну.

Супровідні білки. Рідинна хроматографія (2.2.29), як описано у випробуванні Кількісне визначення». Використовують таку програму:

;	Час(\в)	'	Рухома фаза А		Рухома фаза В	:
		'	(% Об/Оді		(% об/оді
Г	_ 0 -ЗО	:	42		3$	І
І	30 -44 _	;	42 -» 11	•	3$->S9	j
	44-50	[	_11	і.	S9	j

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ І.4	417

Created for http://www.uapf.com.ua

Інсулін людський

Розчини витримують при температурі (2-8) і використовують протягом 24 год. Придатність хроматографічної системи (коефіцієнт розділення, лінійність) перевіряють, як описано в розділі «Кількісне визначення*. Якщо необхідно, коригують співвідношення рухомих фаз для забезпечення повного виходу А21 дезамідоінсудіну свинячого перед початком градієнта. Профіль градієнта може бути откорєгований для забезпечення повного виходу всіх супровідних домішок інсуліну.

Хроматографують 20 мкл розчину порівняння (а). 20 мкт розчину порівняння (Ь). 20 мкл розчину порівняння (с) і 20 мкл випробовуваного розчину. Якшо необхідно, коригують об'єм інжекції у межах від 10 мкл і 20 мкл залежно від виконання вимог із лінійності, як описано в розділі «Кількісне визначення». Хроматографують протягом близько 50 хв. На хроматоірамі розчину порівняння (а) А21 дезамідоінсудін людський виявляється як невеликий пік після основного піка і має відносний час утримування по відношенню до основного піка близько 1.3.

На хроматограмі випробовуваного розчину площа піка А2І дезамідоінсудіну людського не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків; сума площ усіх піків, крім піків інсуліну людського та А21 дезамідоінсудіну людського, не має перевищувати 2.0 % суми площ усіх піків.

Для напівсинтетичного інсуліну людського: на хроматограмі випробовуваного розчину площа будь-якого піка, що відповідає основному піку на хроматограмі розчину порівняння (Ь), не має перевищувати площу відповідного піка на хроматограмі розчину порівняння (с) (1.0 % інсуліну свинячого в інсуліні людському).

Наведене нижче випробування проводять тільки для інсуліну людського, одержаного ферментативною модифікацією інсуліну свинячого.

Проінсуліноподібна імунореактивність (PLI). Не більше 0.001 % (10 ррш), у перерахунку на суху речовину.

Використовують імунохімічний метод із підхожою чутливістю (2.7.1), наприклад кількісне визначення радіоімунологічним методом. Для калібрування використовують Міжнародний Стандартний Реактив проінсуліну свинячого.

Цинк. Не більше 1.0 %, у перерахунку на суху речовину.

Атомно-абсорбційна спектрометрія (2.2.23, метод 1).

Випробовуваний розчин. 50.0 мг субстанції розчиняють у 0.01 М розчині кислоти хлористоводневої та доводять об'єм розчину тією самою кислотою до 25.0 мл. Якщо необхідно, доводять 0.01 Мрозчином кисютихіюристоводневоїю необхідної концентрації (наприклад, від 0.4 мкг/мл Zn до 1.6 мкг/мл Zn).

Розчини порівняння. Свіжоприготовані розчини, що містять 0.40 мкг/мл Zn, 0.80 мкг/мл Zn, 1.00 мкг/мл

Zn. 1.20 мкг/мл Zn, 1.60 мкг/мд Zn. готують відповідними розведеннями еталонного розчину цинку (5мг/мл Zn) 0.0! М розчином кислоти хлористоводневої.

Джерело випромінювання: лампа із порожнистим цинковим катодом.

Довжина хвилі: 2! 3.9 нм.

Полум'я: повітряно-ацетиленове підхожого складу (наприклад, 11 літрів повітря та 2 літри ацетилену за хвилину).

Втрата в масі при висушуванні (2.2.32). Не більше 10.0 %. 0.200 г субстанції сушать при температурі 105 °С протягом 24 год.

Сульфатна зола (2.4.14). Не більше 2.5 %, у перерахунку на суху речовину. Визначення проводять із 0.200 г субстанції.

Бактеріальні ендотоксини (2.6.14). Менше 10 МО/мг, якщо субстанція призначена для виробництва лікарських засобів для парентерального застосування без подальшої процедури видалення бактеріальних ендотоксинів.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Випробовуваний розчин. 40.0 мг субстанції розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої та доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 10.0 мл.

Розчин порівняння (а). Вміст віали ФСЗ інсуліну людського розчиняють у 0.01Мрозчині кислоти хлористоводневої до концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (Ь). Вміст віали ФСЗ інсуліну свинячого розчиняють у 0.01Мрозчині кислоти хлористоводневої до концентрації 4.0 мг/мл.

Розчин порівняння (с). 1.0 мл розчину порівняння (Ь) доводять 0.01 Мрозчином кислоти хлористоводневої

до об'єму 50.0 мл. До 1.0 мл одержаного розчину додають 1.0 мл розчину порівняння (а).

Розчин порівняння (d). 1.0 мл розчину порівняння (а) доводять 0.01 Мрозчином кислоти хлористоводневої

до об'єму 10.0 мл.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи: змішують 1.0 мл розчину порівняння (а) і 1.0 мл розчину порівняння (Ь).

Розчини зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 48 год. Якщо використовують автоматичний інжектор, розчини зберігають при температурі (2-8) °С.

Колонка:

— розмір: 0.25 м х 4.6 мм.

418	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОП ЕЯ УКРАЇНИ і .4

Created for http://www.uapf.com.ua

— нерухома фаза: силікагс ?ь октадекилеші іьний для хроматографії Р{5 мкм).

— температура: 40 °С.

Рухома фаза: рухома фаза А — рухома фаза В (42:58). якщо необхідно, коригують склад суміші.

Наведені нижче розчини готують і витримують при температурі не нижче 20 °С:

—рухома фаза А: 28.4г натрію сульфату безводного Р

розчиняють у воді РІ доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 1000 мл; додають 2.7 мл кислоти фосфорноїР: якщо необхідно, доводять до рН 2.3 етаноламіном Р. фільтрують і дегазують;

—рухома фаза В: змішують 550 мл рухомої фази А та 450 мл ацетонітрилу Р. Одержаний розчин нагрівають до температури не нижче 20 °С для запобігання утворенню осаду (змішування рухомої фази з ацетонітрилом є ендотермічним процесом); фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 214 нм.

Придатність хроматографічної системи:

—коефіцієнт розділення: хроматографують 20 мкл розчину для перевірки придатності хроматоірафічної системи та 20 мкл розчину порівняння (Ь). Час хроматоірафування розчину для перевірки придатності хроматографічної системи має становити не менше часу, необхідного до повного виходу основного піка на хроматограмі розчину порівняння (Ь). На хроматограмі розчину для перевірки придатності хроматографічної системи ідентифікують піки, відповідні інсуліну свинячому та інсуліну людському. Результати аналізу вважаються вірогідними, якшо коефіцієнт розділення для піків інсуліну людського та інсуліну свинячого становить не менше 1.2. Якшо необхідно, для досягнення належного розділення регулюють співвідношення рухомих фаз А і В;

—лінійність: хроматографують 20 мкл розчину порівняння (а) і 20 мкл розчину порівняння (d). Результати аналізу вважаються вірогідними, якщо площа основного піка на хроматограмі розчину порівняння (а) становить (10±0.5) площі основного піка на хроматограмі розчину порівняння

(d). Якщо ця умова не виконується, коригують об'єм інжекції в межах від 10 мкл до 20 мкл залежно від ступеня лінійності сигналу детектора.

Об'єм інжекції: 20 мкл випробовуваного розчину та 20 мкл розчину порівняння (а).

Вміст інсуліну людського C 2 „ H W N 6 S 0 7 7 S 6 у сумі із А 2 1 дезамідоінсуліном людським визначають, використовуючи площі відповідних піків на хроматограмах випробовуваного розчину та розчину порівняння (а) та зазначений вміст інсуліну людського у сумі із А21 дезамідоінсуліном людським у ФСЗ інсуліну людського.

Інсулін розчинний для ін'єкцій

ЗБЕРІГАННЯ

У повітронепроникному контейнері, у захищеному від світла місці, при температурі — 18 °С або нижчій до використання у виробництві. Після розморожування інсулін зберігають при температурі (5±3) °С і використовують у виробництві протягом короткого періоду часу. Для запобігання абсорбції вологи повітря при зважуванні перед відкриванням контейнера інсулін має бути витриманий при кімнатній температурі.

МАРКУВАННЯ

Зазначають: яким саме способом одержують субстанцію: ферментативною модифікацією інсуліну свинячого або за допомогою р-ДНК-технології.

ІНСУЛІН РОЗЧИННИЙ для ІН'ЄКЦІЙ

Insulinum solubile iniectabile

INSULININJECUON, SOLUBLE

Інсулінрозчинний для ін 'єкціймає відповідати вимогам статті «Інсуліну лікарські засоби для ін єкцій» з урахуванням додаткових вимог, зазначених нижче.

Інсулін розчинний для ін'єкцій є нейтральним стерильним розчином інсуліну бичачого, свинячого або людського.

ВЛАСТИВОСТІ

Рідина безбарвна, вільна від опалесценції та сторонніх частинок; протягом зберігання може випасти незначна кількість дуже дрібного осаду.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Переглядають хроматограму. одержану у випробуванні «Кількісне визначення».

На хроматограмі випробовуваного розчину пік інсуліну має відповідати основному піку на хроматограмі відповідного розчину порівняння.

ВИПРОБУВАННЯ

Загальний цинк. Не більше 40.0 мкг/100 МО інсуліну.

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

419