Created for http://www.uapf.com.ua

Інсулін ізофановий для ін'єкцій

максимальний розмір більше 1 мкм. але зрідка більше 60 мкм: великі агрегати мають бути відсутніми.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Переглядають хроматограму, одержану у випробуванні «Кількісне визначення».

На хроматограмі випробовуваного розчину пік інсуліну має відповідати основному піку на хроматограмі відповідного розчину порівняння.

ВИПРОБУВАННЯ

Загальний цинк. Не більше 40.0 мкг/100 МО інсуліну. Визначення проводять, як описано у статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій».

МАРКУВАННЯ

Додатково до вимог, наведених у статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій», має бути зазначено співвідношення розчину інсуліну для ін'єкцій та інсуліну ізофанового для ін'єкцій, використане у процесі виробництва інсуліну ізофанового двофазового для ін'єкцій.

ВЛАСТИВОСТІ

Суспензія білого або майже білого кольору, при відстоюванні якої утворюється білий або майже білий осад і безбарвна або майже безбарвна надосадова рідина; осад легко ресуспендується при обережному струшуванні. Під мікроскопом частинки виглядають як стрижнєподібні кристали, більшість яких мають максимальний розмір більше 1 мкм. але зрідка більше 60 мкм; великі агрегати мають бути відсутніми.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Переглядають хроматограму, одержану у випробуванні «Кількісне визначення».

На хроматограмі випробовуваного розчину пік інсуліну має відповідати основному піку на хроматограмі відповідного розчину порівняння.

ВИПРОБУВАННЯ

Загальний цинк. Не більше 40.0 мкг/100 МО інсуліну. Визначення проводять, як описано у статті«Інсуліну лікарські засоби для ін єкцій».

ІНСУЛІН ІЗОФАНОВИЙ для ІН'ЄКЦІЙ

Insulinum isophanum iniectabile

INSULIN INJECnON, ISOPHANE

Інсулін ізофановий для ін'єкцій має відповідати вимогам статті «Інсуліну лікарські засоби для ін'єкцій» з урахуванням додаткових вимог, зазначених нижче.

Інсулін ізофановий для ін'єкцій є стерильною суспензією бичачого, свинячого або людського інсуліну у комплексі із протаміну сульфатом або іншим підхожим протаміном.

ВИРОБНИЦТВО

Інсулін ізофановий для ін'єкцій готують, як описано у статті «Інсулінулікарські засоби для ін'єкцій».

Кількість протаміну зумовлена відомим ізофановим співвідношенням та становить не менше еквівалента 0.3 мг і не більше еквівалента 0.6 мг протаміну сульфату у 100 МО інсуліну в інсулін-протаміновому комплексі.

ІНСУЛІН ЛІЗПРО

Insulinum lisprum

INSULIN LISPRO

і

1

Н - Gly - lie - Val - Glu - Gin - Cys - Cys - Thr - Ser - lie - Cys - Ser -

Leu - Tyr - Gin - Leu - Glu - Asn - Tyr - Cys - Asn - OH

201

I

H - Phe - Val - Asn - Gin - His - Leu - Cys - Gly - Ser - His - Leu -

Val - Glu - Ala - Leu - Tyr - Leu - Val - Cys - Gly - Glu - Arg -

20

Gly - Phe - Phe - Tyr - Thr - Lys - Pro - Thr - OH

C2S7H,S3N65077S6

M.M.5808

28В-Ь-Лізил-29В -L-проліл інсулін (людський).

Інсулін лізпро є 2-ланцюговим пептидом, що складається із 51 амінокислоти. А-ланцюг складається із 21 амінокислоти. В-ланцюг складається із ЗО амінокислот. Його первинна структура така сама, що і інсуліну людського, різниця полягає тільки у порядку положень амінокислот у позиціях 28 і 29

В-ланцюга. Інсулін людський є Pro(B2S), Lys(B29).

аінсулін лізпро - Lys(B28), Рго(В29). Як і інсулін людський, інсулін лізпро містить 2 міжданцюговпх

412	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

Created for http://www.uapf.com.ua

Інсулін лізпро

дисульфідних зв'язки та 1 дисульфідний зв'язок у межах ланцюга.

Вміст: від 94.0 % до 104 %, у перерахунку на суху речовину.

Умовно, для маркування препаратів інсуліну лізпро, приймають, шо 0.0347 мг інсуліну лізпро відповідає 1 МО інсуліну.

ВИРОБНИЦТВО

Інсулін лізпро одержують за допомогою технології рекомбінантної ДНК (р-ДНК) за умов, що мінімізують ризик мікробіологічного забруднення.

Попередньо для кожної серії кінцевого нерозфасованого продукту проводять наведені нижче випробування. Дані випробування не проводять, якщо відповідність даному випробуванню гарантовано компетентним уповноваженим органом.

Залишкові білки клітини-хазяїна. Межі встановлюються компетентним уповноваженим органом.

Одноланцюговий попередник. Межі встановлюються компетентним уповноваженим органом. Використовують метод із підхожою чутливістю.

ВЛАСТИВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору.

Розчинність. Практично не розчинний у воді Р та 96 % спирті Р. Розчиняється у розведених мінеральних кислотах і із розкладанням у розведених розчинах гідроксидів лужних металів.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

A. Переглядають хроматограму, одержану у випробувані «Кількісне визначення».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчину час утримування основного піка має співпадати із часом утримування основного піка на хроматограмі розчину порівняння.

B. Пептидне картування (2.2.55).

СЕЛЕКТИВНИЙ РОЗРИВ ПЕПТИДНИХ ЗВ'ЯЗКІВ

Випробовуваний розчин. Готують розчин 2.0 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 М розчині кисіоти хлористоводневої, 500 мкл одержаного розчину переносять у чисту пробірку і додають 2.0 мл HEPES буферного розчину рН 7.5 Р і 400 мкл розчину І мг/ мл протеази Staphylococcus aureus штам VS. тип XV11-B P. Пробірку закривають та інкубують при температурі 25 °С протягом 6 год. Реакцію зупиня-

ють додаванням 2.9 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р.

Розчин порівняння. Готують аналогічно випробовуваному розчину, замість випробовуваної субстанції додають ФСЗ інсуліну лізпро.

ХРОМАТОГРАФІЧНЕ РОЗДІЛЕННЯ

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Колонка:

—розмір: 0.10 м х 4.6 мм,

—нерухома фаза: силікагель октадецшісилпьний д.ія хроматографії Р (3 мкм) із розміром nop 8 нм,

—температура: 40 °С.

Рухома фаза:

—рухома фаза А: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 700 мл води Р і 100 мл ацетонітрилу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

—рухома фаза В: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 400 мл води Р і 400 мл ацетонітрилу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

Час (хв)	;	Рухома фаза А	Рухома фаза В 1
і		(% об/оо)	(% об/об)
0-60	!	90->30	10->70
60-65		30->0	70-> 100
65 - 70		0	100
Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.
Детектування:	спектрофотометрично за довжини
хвилі 214 нм.

Урівноваження колонки: не менше 15 хв за вихідних умов. Одержують хроматограму холостого розчину', використовуючи наведений вище градієнт.

Об'єм інжекції: 50 мкл.

Придатність хроматографічної системи:

—хроматограми випробовуваного розчину та розчину порівняння мають співпадати із хроматограмою інсуліну лізпро, що додається до ФСЗ інсуліну лізпро,

—на хроматограмі розчину порівняння ідентифі-

кують піки, що відповідають фрагментам 1, 11

і 111:

—коефіцієнт симетрії: не більше 1.5 для піків, що відповідають фрагментам 11 і 111,

—коефіцієнт роздиеиня: не менше S для піків, що відповідають фрагментам 11 і 111.

Результати: хроматографічний профіль випробовуваного розчину має відповідати хроматографічному профілю розчину порівняння.

ПРИМІТКА: часи утримування фрагментів 1, II і IV однакові д,ш інсуліну лізпро та д.ія інсуліну людського. Час утримування фрагмента 111 відрізняється від інсуліну людського порядком паюжень _\s і 2s) В-.шнцюга.

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

413

Created for http://www.uapf.com.ua

Інсулін лізпро

ВИПРОБУВАННЯ

Домініки ІЗ молекулярно» масою, більшою за молекулярну масу інсуліну лізпро. Ексклюзивна хроматографія (Г.Г.Л^. Використовують метод внутрішньої нормалізації.

Випробовуваний розчин. Готують розчин, шо містить 4 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 Мрозчині кисюти хлористоводневої. Розчин зберігають при температу рі (2-8) °С і використовують протягом 48 год.

Розчин д.ія перевірки придатності хроматографічної системи. Використовують розчин інсуліну (близько 4 мг/мл). шо містить більше 0.4 % високомолєкудярних білків. Можуть бути використані лікарські засоби інсуліну для ін'єкцій, такі як розчин або суспензія, освітлені певною кількістю б М розчину кисюти хлористоводневої. що містять визначений відсотковий вміст високомолекудярних білків, або розчин субстанції інсуліну в 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої. Інсулін, що містить визначений відсотковий вміст високомолекулярних білків, може бути приготований із субстанції інсуліну, витриманої при кімнатній температурі протягом 10 діб. Розчин зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 8 діб.

Колонка:

—розмір: 0.30 м х 7.5 мм,

—нерухома фаза: силікагель гідрофільний для хроматографії Р (5-10 мкм) із розміром nop (1212.5) мкм, підхожий для розділення мономерів інсуліну від димерів і полімерів.

Рухома фаза: кислота оцтова льодяна Р - ацетонітрил для хроматографії Р - розчин 1.0 г/л аргініну Р

(15:20:65). Одержану суміш фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 0.5 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвшіі 276 нм.

Урівноваження колонки: Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи хроматографують не менше 3 разів. Колонка вважається врівноваженою, якщо для двох послідовних інжекцій одержано однакові результати.

Об'єм інжекції: 100 мкл.

Час хроматографування: близько 35 хв.

Часи утримування: полімери інсуліну лізпро - (1317) хв. димер інсуліну лізпро — близько 17.5 хв; мономер інсуліну лізпро — близько 20 хв, солі — близько 22 хв.

Придатність хроматографічної системи: розчин для перевірки придатності хроматографічної системи:

— хроматографічна система вважається придатною, якщо відношення Ир до Нг не менше 2.0. де Ир - висота піка димеру над базовою лінією, Я,. - висота над базовою лінією найнижчої точки

хроматограми між піком димеру та піком мономеру.

—коефіцієнт симетрії: не більше 2.П для піка інсуліну лізпро.

Нормування: сума площ піків із часом утримування меншим ніж час утримування основного піка не більше 0.25 % суми площ піків. Не враховують піки із часом утримування більшим, ніж час утримування піка мономеру інсуліну лізпро.

Супровідні білки. Рідинна хроматографія (2.2.29). Використовують метод внутрішньої нормалізації.

Випробовуваний розчин. 3.5 мг субстанції розчиняють в 1.0 мл 0.01 Мрозчину кислоти хлористоводневої.

Розчин зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 56 год.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. 3.5 мг субстанції розчиняють в 1.0 мл 0.01 М розчину кислоти хлористоводневої і витримують при кімнатній температурі до одержання розчину із вмістом А21 дезамідоінсуліну лізпро від 0.8 % до 11 %.

Колонка:

—розмір: 0.25 м х 4.6 мм,

—нерухома фаза: силікагель октадецилсилільний для хроматографіїР (5 мкл) із розміром nop 30 нм,

—температура: 40 °С.

Рухома фаза:

—рухома фаза А: розчин 28.4 г/л натрію сульфату безводного Р, рН якого доведено до 2.3 кислотою фосфорною Р, - ацетонітрил для хроматографії Р

(82:18). Одержану суміш фільтрують і дегазують:

—рухома фаза В: суміш рівних об'ємів розчину

28.4г/л натрію сульфату безводного Р, рН якого доведено до 2.3 кислотою фосфорною Р. і ацетонітрилу для хроматографії Р. Одержану суміш фільтрують і дегазують;

і	Час (хв)		Рухома фаза А	Рухома фаза В
			" (% об/об)	* (% об/об)
і	0-60		81	19
	60 - 83		81->51	19->49
	83 - 84	і	51->81	49-> 19
і	84-94	;	81	19	і
Швидкість рухомої			фази: 1 мл/хв.
Детектування:		спектрофотометрично за довжини
хвилі 214 нм.

Об'єм інжекції: 20 мкл.

Часи утримування: коригують склад рухомої фази до одержання часу утримування для інсуліну лізпро близько 41 хв; А21 дезамідоінсудін лізпро єдююється перед початком градієнта.

Придатність хроматографічної системи: розчин дія перевірки ступеня розділення:

—коефіцієнт розділення: не менше 1.5 для 1го піка (інсулін лізпро) і 2,х> піка (А21 дезамідоінсудін лізпро).

414	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

Created for http://www.uapf.com.ua

—коефіцієнт симетрії: не більше 2.0 для піка інсуліну лізпро.

Нормування:

—Л21 дезамідоінсулінлізпро: не більше 1.0. %,

—будь-яка інша домішка: не більше 0.50 %,

—сума домішок (за виключенням А21): не більше

2.0%.

Цинк. Не більше 1.0 %, у перерахунку на суху речовину.

Атомно-абсорбційна спектрометрія {2.2.23, метод І).

Випробовуваний розчин. 50 мг субстанції розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої та доводять об'єм розчину тією самою кислотою до 25 мл. Якшо необхідно, розводять 0.01 Мрозчином кислоти хлористоводневої до необхідної концентрації (наприклад, від 0.4 мкг/мл Zn до 0.6 мкг/мл Zn).

Розчини порівняння. Використовують свіжоприготовані розчини із концентраціями, що охоплюють передбачені концентрації Zn у випробовуваному розчині, наприклад, від 0.2 мкг/мл Zn до 0.8 мкг/мл Zn, приготовані розведеннями еталонного розчину цинку (5мг/мл Zn)P 0.01 Мрозчином кислоти хлористоводневої.

Джерело випромінювання: лампа із порожнистим цинковим катодом.

Довжина хвилі: 213.9 нм.

Полум'я: повітряно-ацетиленове підхожого складу (наприклад, 11 літрів повітря та 2 літри ацетилену за хвилину).

Втрата в масі при висушуванні (2.2.32). Не більше 10.0 %. 0.200 г субстанції сушать при температурі 105 °С протягом 16 год.

Сульфатна зола (2.4.14). Не більше 2.5 %, у перерахунку на суху речовину. Визначення проводять із 0.200 г субстанції.

Бактеріальні ендотоксини (2.6.14, метод D). Менше 10 МО/мг, якщо субстанція призначена для виробництва лікарських засобів для парентерального застосування без подальшої процедури видалення бактеріальних ендотоксинів.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Випробовуваний розчин. Субстанцію розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневої до концентрації 0.8 мг/мл. Розчин зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 48 год.

Розчин порівняння. Вміст віали ФСЗ інсуліну лізпро розчиняють у 0.01 Мрозчині кислоти хлористоводневоїт концентрації0.8 мг/мл. Одержаний розчин

Інсулін лізпро

зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 48 год.

Розчин для перевірки придатності хроматографічної системи. Близько 10 мг субстанції розчиняють у 10 мл 0.01 Мрозчину кислоти хлористоводневої^ витримують при кімнатній температурі до одержання розчину із вмістом А21 дезамідоінсуліну лізпро від 0.8 % до 11%. Розчин зберігають при температурі (2-8) °С і використовують протягом 14 діб.

Колонка:

—розмір: 0.10 м х 4.6 мм,

—нерухома фаза: силікагель октадецилсилільний для хроматографії Р (3 мкл) із розміром nop 8 нм,

—температура: 40 °С.

Рухома фаза:розчин 28.4 г/л натрію сульфату безводного Р, рН якого доведено до 2.3 кислотою фосфорною Р, - ацетонітрил для хроматографії Р (745:255). Одержану суміш фільтрують і дегазують.

Швидкість рухомої фази: 0.8 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично за довжини хвилі 214 нм.

Об'єм інжекції: 20 мкл.

Часутримування: інсуліну лізпро близько 24 хв.

Придатність хроматографічної системи:

—коефіцієнт розділення: не менше 1.8 для 1го піка (інсулін лізпро) і 2го піка (А21 дезамідоінсулін лізпро) на хроматограмі розчину для перевірки придатності хроматографічної системи,

—збіжність: максимальне стандартне відхилення після 3 інжекцій розчину порівняння не більше

1.1%.

Вміст інсуліну лізпро Ci57H3g3N4sO„S4 визначають, використовуючи хроматоірами випробовуваного розчину та розчину порівняння та зазначений вміст

C2S7H3S3Nfo-07,S6y ФСЗ інсуліну лізпро.

ЗБЕРІГАННЯ

У повітронепроникному контейнері, у захищеному від світла місці, при температурі — 18 °С або нижчій. Після розморожування інсулін лізпро зберігають і зважують у визначених виробником умовах, що гарантують якість субстанції, та використовують у виробництві протягом короткого періоду часу. Для запобігання абсорбції вологи повітря при зважуванні інсулін лізпро перед відкриванням контейнера має бути витриманий при кімнатній температурі.

ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

415