Created for http://www.uapf.com.ua

2.4 Випробування на гранїчннй вміст домішок

Придатність системи:

—пляма на фільтрі, одержана для розчину порівняння. повинна мати коричневе забарвлення при порівнянні з плямою, одержаною для холостого розчину;

—забарвлення плями на фільтрі, одержаної для контрольного розчину, має бути не менш інтенсивним. за забарвлення плями для розчину порівняння.

Результат: коричневе забарвлення плями на мембранному фільтрі. одержане у випробуванні з випробовуваним розчином, не має бути більш інтенсивним за забарвлення плями на мембранному фільтрі, одержане у випробуванні з розчином порівняння.

МЕТОД Н

Випробовуваний розчин. Зазначену в окремій статті кількість випробовуваної субстанції розчиняють в 20 мл зазначеного розчинника або зазначеної суміші розчинників.

Розчин порівняння. Зазначений об'єм еталонного розчину свинцю (10ррт РЬ) Р розводять до об'єму 20 мл зазначеним розчинником або зазначеною сумішшю розчинників.

Холостий розчин. 20 мл зазначенного розчинника або зазначеної суміші розчинників.

До кожного розчину додають 2 мл буферного розчину з рН 3.5 Р. Перемішують. (У деяких випадках відбувається випадання осаду, в такому разі в окремій статті описується повторнерозчинення в зазначеному об'ємі даногорозчинника). Додаютьдо 1.2 мл тіоацетамідногореактиву Р. Немедленно перемішують і залишають на 2 хв. Розчини фільтрують крізь підхожий мембранний фільтр (номінальний розмір пір 0.45 мкм). Проводять порівняння плям на фільтрах, одержаних для різних розчинів.

Придатність системи: пляма на фільтрі, одержана для розчину порівняння, повинна мати корич- нювато-чорне забарвлення при порівнянні з плямою. одержаною для холостого розчину.

Результат: коричнювато-чорнє забарвлення плями

на мембранному фільтрі, одержане у випробуванні з випробовуваним розчином, не має бути більш інтенсивним за забарвлення плями на мембранному фільтрі, одержане у випробуванні з розчином порівняння.

2.4.14. СУЛЬФАТНА ЗОЛА(1)

Підхожий тигель (наприклад, кремнієвий, платиновий, фарфоровий або кварцовий) прожарюють при температурі (600+50) °С протягом ЗО хв, залишають до охолодження в ексикаторі над силікагелем або іншою підхожою висушуючою речовиною і зважують. Зазначену кількість випробовуваної речовини поміщають у тигель і зважують. Речовину змочують невеликою кількістю кислоти сірчаної Р (звичайно 1 мл) і обережно нагрівають при можливо більш низькій температурі до повного обвуглювання зразка. Після охолодження залишок змочують невеликою кількістю кислоти сірчаної Р (звичайно 1 мл), обережно нагрівають до появи білої пари і після її нетривалого виділення залишок прожарюють при температурі (600±50) °С до його повного обвуглю- В2.ННЯ. Стежать затим, щоб під час прожарвання не виникало полум'я. Тигель залишають охолоджуватися в ексикаторі над силікагелем або іншою підхожою висушуючою речовиною, знову його зважують і розраховують процентний вміст залишку.

Якщо кількість залишку, одержаного таким чином, перевищує зазначену межу вмісту, залишок повторно змочують кислотою сірчаною Рї повторно прожарюють протягом ЗО хв таким самим чином, поки 2 послідовних зважування не відрізнятимуться більш як на 0.5 мг або поки процентний вміст залишку відповідатиме зазначеній межі вмісту.

Кількість субстанції, шо використовується у випробуванні (звичайно від 1 гдо 2 г), вибирають так, щоб зазначену межу маси залишку (звичайно близько 1 мг) можна було визначиш з достатньою правільністю.

1) Дана стаття бьілз переглянута відповідно до фармакопейної' гармонізації. Див. статтю 5.5і. «Фармакопейна гармонізація»

60	Дї-іРЖАВНАФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

Created for http://www.uapf.com.ua

=2.5 Методи кількісного визначення

2.5.МЕТОДИ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ

2.5.24. ДІОКСИД ВУГЛЕЦЮ В ГАЗАХ

Гази легко поглинають за одної або більше специфічних довжинах хвиль. Цю властивість широко використовують для високовибіркового визначення їх концентрацій.

Опис і принцип вимірювання. Концентрацію закису азоту вуглецю в інших газах можна визначити з використанням інфрачервоного аналізатора.

Інфрачервоний аналізатор звичайно містить джерело випромінювання, що генерує інфрачервоне випромінювання в широкому діапазоні, оптичний пристрій, комірку для зразка та детектор. Оптичний пристрій може бути розташований перед або за коміркою для зразка і містить один або декілька оптичних фільтрів, через які проходить широкосмугове випромінювання. Оптичний пристрій у цьому разі вибірковий для діоксиду вуглецю. Світловий промінь, який підлягає вимірюванню, проходить через комірку для зразка і може також проходити через комірку порівняння, якщо аналізатор влаштований таким чином (деякі використовувані електронні системи використовуються замість комірки порівняння).

Якщо в комірці для зразка знаходиться діоксид вуглецю, відбуватиметься поглинання енергії вимірюваного світлового променя відповідно до закону Ламберта-Бера і це викликатиме зміни в сигналі детектора. Даний сигнал, що детеюгується, порівнюється із сигналом, одержаним для комірки порівняння для одержання даних для розрахунку концентацц діоксиду вуглецю. Сигнал, що генерується, піддається лінеаризації для того, щоб одержати в підсумку значення коцентрації діоксиду вуглецю. Для попередження попадання частинок у сенсор, які можуть стати причиною явища розсіяння світла, прилад забезпечений підхожим фільтром.

Вимоги технічних специфікацій. При використанні для граничного випробування інфрачервоний аналізатор має задовольняти такі вимоги:

Межа детектування: (звичайно визначається при відношення сигнал/шум, що дорівнює 2) не більше 20 % максимально допустимої концентрації;

Відтворюваність: RSD не більше 10 % від максимально допустимої концентрації, визначене з 6 вимірювань;

Лінійність: не більше 10 % від максимально допустимої концентрації, визначена з 6 вимірювань;

Вимоги мають виконуватися у присутності домішок іншого газу в зразку.

2.5.25. ОКСИД ВУГЛЕЦЮ В ГАЗАХ

МЕТОД І

Прилад. Прилад (Рис. 2.5.25.-1) складається з таких послідовно сполучених частин.

—U-подібна трубка ( щ о містить безводний силікагель Р, просочений триоксидом хрому Р:

—промивна ємність (JFJ), що містить 100 мл розчину 400 г/л калію гідроксиду Р;

—U-подібна трубка (U2 ). шо містить гранули калію гідроксиду Р:

— U-подібна	трубка (Us), що містить фосфо-
ру (V) оксид	Р, диспергований на поверхні за-
здалегідь гранульованої плавленої пемзи;

— U-подібна трубка (С/4), що містить 30 г гранульованого йоду(У) оксиду перекристалізованого Р,

заздалегідь висушеного при температурі 200 °С і підтримуваної в ході проведення випробування при температурі 120 °С (7). П'ятиокис йоду розташовують у трубці стовпчиками заввишки 1 см, розділеними стовпчиками скловати заввишки 1 см, так, щоб ефективна довжина складала

5 см;

—реакційна пробірка (F,), що містить 2.0 мл розчину калію йодиду Р ї 0.15 мл розчину крохмалю Р.

Методика. Прилад промивають 5.0 л аргону PL якщо необхідно, знебарвлюють розчин йодиду, додаючи

Рисунок 2.5.25.-1. Прилад для визначення оксиду вуглецю в медичних газах Розміри наведені вміліметрах

66 ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4	61?

Created for http://www.uapf.com.ua

ї . д методи кількісного визначення

мінімально необхідну кількість свіжоприготованого

0.002 М розчину тіосульфату натрію. Цю операцію продовжують доти, поки після пропускання через прилад чергових 5.0 л аргону Рна знебварвлення буде потрібно не більше 0.045 мл 0.002 Мрозчину натрію тіосульфату. Зазначену кількість випробовуваного газу пропускають із циліндра через прилад із зазначеною швидкістю. Для вимивання залишків йоду, що виділився, з приладу в реакційну пробірку, через прилад пропускають 1.0 л аргону Р. Йод, що виділився, титрують 0.002 Мрозчином натрію тіосульфату.

Проводять холостий дослід з використанням зазначеної кількості аргону Р. Різниця об'ємів 0.002 Мрозчину натрію тіосульфату, що пішли на титрування, не має перевищувати зазначеної межі.

МЕТОД 11

Гази легко поглинають за одної або більше специфічних довжинах хвиль. Цю властивість широко використовують для високовибіркового визначення їх концентрацій.

Опис і принцип вимірювання. Концентрацію оксиду вуглецю (чадний газ) в інших газах можна визначити з використанням інфрачервоного аналізатора.

Інфрачервоний аналізатор звичайно містить джерело випромінювання, що генерує інфрачервоне випромінювання в широкому діапазоні, оптичний пристрій, комірку для зразка та детектор. Оптичний пристрій може бути розташований перед або за коміркою для зразка і містить один або декілька оптичних фільтрів, через які проходить широкосмугове випромінювання. Оптичний пристрій у цьому разі вибірковий для вуглецю діоксиду. Світловий промінь, який підлягає вимірюванню, проходить через комірку для зразка і може також проходити через комірку порівняння, якщо аналізатор влаштований таким чином (деякі використовувані електронні системи використовуються замість комірки порівняння).

Якщо в комірці для зразка знаходиться оксид вуглецю, відбуватиметься поглинання енергії вимірюваного світлового променя відповідно до закону Ламберта-Бера і це викликатиме зміни в сигналі детектора. Даний сигнал, що детектується, порівнюється з сигналом, одержаним для комірки порівняння для одержання даних для розрахунку концентрації вуглецю оксиду. Сигнал, що генерується, піддається лінеаризації, для того, щоб одержати у підсумку значення коцентрації діоксиду вуглецю. Для попередження попадання частинок в сенсор, які можуть стати причиною явища розсіяння світла, прилад забезпечений підхожим фільтром.

Вимоги до технічних специфікацій. При використанні для граничного випробування інфрачервоний аналізатор має задовольняти такі технічні специфікації:

Межа детектування: (звичайно визначають при відношенні сигнал/шум, що дорівнює 2) не більше 20 % максимально допустимої концентрації;

Відтворюваність: RSD не більше 10 % від максимально допустимої концентрації, визначене з 6 вимірювань;

Лінійність: не більше 10 % від максимально допустимої концентрації, визначена з 6 вимірювань;

Вимоги технічних специфікацій мають виконуватися у присутності домішок іншого газу в зразку.

2.5.31. РИБОЗА В ПОЛІСАХАРИДНИХ ВАКЦИНАХ

Випробовуваний розчин. Для приготування розчину, що містить близько 5 мг/мл сухого полісахариду, використовують мірну колбу підхожого об'єму. Вміст ампули кількісно переносять за допомогою води Ру колбу і доводять тим самим розчинником так, щоб у використовуваному у випробуванні об'ємі розчину вміст рибози складав від 2.5 мкг до 25 мкг. Поміщають 0.20 мл і 0.40 мл розведеного розчину в пробірки, отримуючи три серії кожного розчину.

Розчини порівняння. Розчиняють 25 мг рибози Ру воді Р і доводять розчин цим самим розчинником до 100.0 мл (основний розчин; 0.25 r/л рибози). Безпосередньо перед використанням розводять 1 мл основного розчину до 10.0 мл водою Р (робоча концентрація: 25 мг/л рибози). Поміщають 0.10 мл; 0.20 мл;

0.40мл; 0.60 мл; 0.80 мл і 1.0 мл робочої концентрації

у6 пробірок.

Готують холостий розчин, використовуючи 2 мл

води Р.

Доводять об'єм у кожній пробірці до 2 мл, використовуючи воду Р. Струшують. Додають у кожну пробірку по 2 мл розчину 0.5 г/л заліза хлориду Р у кислоті хлористоводневій Р. Струшують. Додають 0.2 мл розчину 100 г/л орцину Ру етанолі Р. Пробірки поміщають на водяну баню на 20 хв. Охолоджують у льодяній воді. Вимірюють оптичну густину (2.2.25) кожного розчину за довжини хвилі 670 нм, використовуючи холостий розчин як компенсаційний розчин. За одержаними значеннями оптичної густини для 6 стандартних розчинів і відповідного вмісту рибози будують калібрувальну криву і визначають вміст рибози у випробовуваному розчині для кожного об'єму. Розраховують середнє з 3 одержаних значень.

2.5.33. ЗАГАЛЬНИЙ БІЛОК

Багато аналітичних методик, описаних у даній загальній статті, можуть проводитися з використанням наявних у продажу наборів.

МЕТОД 1

Білок у розчині поглинає ультрафіолетове випромінювання за довжини хвилі 2N0 нм у зв'язку з наявністю в структурі білка ароматичних амінокислот, головним чином тирозину і тршпофану. Дана

62	П PP^Jv' A R H А т д р \ ; А К ГИ і f- fl V k PA і Н Н 1 4

Created for http://www.uapf.com.ua

=2.5 Методи кількісного визначення

властивість білків може використовуватися з метою їх кількісного визначення. Якщо буферний розчин, використовуваний для розчинення білка, має велику оптичну густину відносно води, він містить речовини, що заважають. Вплив заважаючих речовин може бути усуненим використанням буферного розчину як компенсаційного розчину, але, якщо речовина, що заважає, має високу оптичну густину, отримані результати можуть проте викликати сумнів. При низьких концентраціях білка його адсорбція на кюветі може призвести до істотного зниження його концентрації у розчині. Цьому можна запобігти шляхом приготування зразків із високою концентрацією або використовуванням при приготуванні розчинів неіоногенних детергентів.

Випробовуваний розчин. Необхідну кількість випробовуваної речовини розчиняють у зазначеному буферному розчині для отримання розчину з концентрацією білка в інтервалі від 0.2 мг/мл до 2 мг/мл.

Розчин порівняння. Готують розчин відповідного стандартного зразка для визначуваного білка в тому самому буферному розчині і з тією самою концентрацією, що і у випробовуваного розчину.

Методика. При виконанні даного випробування випробовуваний розчин, розчин порівняння і компенсаційний розчин зберігають при однаковій температурі. Визначають оптичну густину (2.2.2$) випробовуваного розчину і розчину порівняння в кварцових кюветах за довжини хвилі 280 нм, використовуючи зазначений буферний розчин як компенсаційний розчин. Для отримання правильних результатів має спостерігатися лінійна залежність у діапазоні визначуваних концентрацій білка.

Світлорозсіяння. Правильність визначення білка може бути знижена за рахунок розсіяння світла розчином випробовуваного зразка. Якщо білок у розчині знаходиться у вигляді частинок, зіставних за розмірами з довжиною хвилі вимірюючого випромінювання (від 250 нм до 300 нм), розсіювання світлового потоку призводить до уявного збільшення оптичної густини розчину випробовуваного зразка. Щоб розрахувати оптичну густину задовжини хвилі 280 нм з урахуванням світлорозсіяння, визначають оптичну густину випробовуваного розчину за довжин хвиль - 320 нм, 325 нм, 330 нм, 335 нм, 340 нм, 345 нм і 350 нм. Будують графік залежності логарифмів виміряних оптичних густин від логарифмів довжин хвиль і, використовуючи лінійну регресію, визначають якнайкращу апроксимацію стандартної кривої. Для визначення логарифма оптичної густини за довжини хвилі 280 нм криву екстраполюють. Антилогарифм даного значення є оптичною густиною, визначуваною світлорозсіянням.

Виміряні значення коректують: із отриманої загальної оптичної густини, виміряної за довжини хвилі 280 нм, віднімають оптичну густину, визначувану світлорозсіянням, отримуючи таким чином оптичну густину біл ка в розчині. Для зменшення впливу світ-

лорозсіяння, особливо при помітній каламутності розчину, можна провести фільтрування, використовуючи неадсорбуючий білок (фільтр з розміром пір 0.2 мкм), або освітлення центрифугуванням.

Розрахунки. Для розрахунків використовують відкоректовані значення. Розраховують концентрацію білка у випробовуваному розчині (С0), використовуючи рівняння:

Cs(Au//4$),

де:

Cs — концентрація білка в розчині порівняння; Аи і As — відкоректовані значення оптичної густини, отримані для випробовуваного розчину і

розчину порівняння, відповідно.

МЕТОД2

Даний метод, звичайно званий методом Лоурі, заснований на відновленні білком фосфорномолібденвольфрамового змішаного кислого хромогену у фосфорномолібденвольфрамовому реактиві, що призводить до максимуму поглинання за 750 нм. Фосфорномолібденвольфрамовий реактив реагує, головним чином, із залишками тирозину в білку. Ступінь забарвлення досягає свого максимуму через проміжок часу від 20 хв до ЗО хв при кімнатній температурі, після чого відбувається поступове знебварвлення. Оскільки даний метод є чутливим до речовин, що заважають, можна використовувати процедуру для осадження білка з випробовуваної проби. Більшість речовин, що заважають, викликають слабке забарвлення, хоча застосування деяких детергентів може викликати посилення забарвлення. Висока концентрація солей може викликати осадження білка. Оскільки різні види білка можуть давати різні за інтенсивністю забарвлення, стандартний зразок білка і випробовуваний білок мають бути аналогічними. Коли необхідне відділення речовин, що заважають, від білка у випробовуваному зразку, проводять процедуру, описану нижче для речовин, що заважають, перед приготуванням випробовуваного розчину. Вплив речовин, що завжають, може бути мінімізований розведенням, що забезпечує концентрацію випробовуваного білка на рівні, достатньому для проведення правильних вимірювань.

Для приготування всіх буферних розчинів і реактивів, вживаних в даному методі, використовують

воду дистильовану Р.

Випробовуваний розчин. Кількість випробовуваної речовини, достатню для отримання розчину з концентрацією білка усередині діапазону концентрацій стандартної кривої, розчиняють у буферному розчині, зазначеному в окремій статті. Відповідний буферний розчин дає рН випробовуваного розчину від 10.0 до 10.5.

Розчини порівняння. Стандартний зразок випробовуваного білка розчиняють у буферному розчині.

66 ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

63?

Created for http://www.uapf.com.ua

2.5 Метода кількісного визначення

зазначеному в окремій статті. Порції даного розчину розводять таким самим буферним розчином, щоб отримати не менше п'яти розчинів порівняння з концентраціями білка, рівномірно розподіленими у підхожому інтервалі концентрацій у діапазоні від 5 мкг/мл до 100 мкг/мл.

Холостийрозчин. Використовують буферний розчин, використовуваний для приготування випробовуваного розчину і розчинів порівняння.

ристовуючи вихрову мішалку, перемішують розчин і залишають при кімнатній температурі упродовж 10 хв. Потім додають 0.1 мл розчину 720 г/л трихлороцтової кислоти Р і перемішують за допомогою вихрової мішалки. Центрифугують при прискоренні З 000 g упродовж 30 хв, декантують і видаляють залишкову рідину піпеткою. Осад білка знову розчиняють в 1 мл реактиву лужної міді.

Реактив міді сульфату. 100 мг міді (II) сульфату Р і 0.2 натрію тартрату ^розчиняють у воді дистильованій Рі доводять об'єм розчину до 50 мл тим самим розчинником. 10 г натрію карбонату безводого Ррозчиняють у воді дистильованій Р і доводять об'єм розчину до 50 мл тим самим розчинником. До розчину міді сульфату поволі при перемішуванні додають розчин натрію карбонату. Використовують упродовж 24 год.

Реактивлужноїміді. Змішують реактив міді сульфату, розчин 50 г/л натрію додецилсульфату Рі розчин 32 г/л натрію гідроксиду Ру співвідношенні (1:2:1). Зберігають при кімнатній температурі і використовують упродовж 2 тижнів.

Фосфоромолібденовольфрамовийреактив розведений. Змішують 5 мл фосфоромолїбденвольфрамового реактиву Рз 55 мл води дистильованоїР. Зберігають у посуді з темного скла при кімнатній температурі.

Методика. До 1.0 мл кожного з розчинів порівняння, випробовуваного розчину і холостого розчину додають 1.0 мл реактиву лужної міді і перемішують. Залишають на 10 хв. Потім додають 0.5 мл розведеного фосфорномолібденового реактиву, перемішують і залишають при кімнатній температурі на ЗО хв. Визначають оптичну густину (2.2.25) розчинів за довжини хвилі 750 нм, використовуючи холостий розчин ж компенсаційний розчин.

Розрахунки. Залежність оптичної густини розчину від концентрації білка в розчині не є лінійною; проте, якщо діапазон концентрацій, використовуваних для побудови стандартної кривої, достатньо невеликий, він близький до лінійності. Будують графік залежності оптичної густини розчинів порівняння від концентрацій білка в розчині і, використовуючи лінійну регресію, визначають стандартну криву. На підставі стандартної кривої і оптичної густини випробовуваного розчину визначають концентрацію білка у випробовуваному розчині.

Заважаючі речовини. В описаній нижче методиці дезоксихольовотрихлороцтову кислоту додають до випробовуваного зразка перед випробуванням для видалення заважаючих речовин шляхом осадження білка; дана методика може бути використана для концентрації білків з розведених розчинів.

До 1 мл розчину випробовуваної речовини додають 0.1 мл розчину 1.5 r/л натрію дезоксихшату Р. Вико-

МЕТОД З

Даний метод (звичайно званий визначенням за Бредфордом) заснований на зсуві поглинання з довжини хвилі 470 нм до 595 нм, спостережуваному при зв'язуванні білків фарбником кислотним синім 90. Фарбник кислотний синій 90 зв'язує найактивніше аргінінові і лізинові залишки в білку, що може призвести до похибки результатів при кількісному визначенні різних білків. Білки, використовувані як стандартна речовина, мають бути такими самими, як і білки, призначені для випробування. Речовин, що заважають випробовуванню, відносно небагато, але все ж таки слід уникати детергентів і амфолітів у випробовуваному зразку. Високолужні проби можуть взаємодіяти з кислотними реактивами.

Для приготування всіх буферних розчинів і реактивів, вживаних уданому методі, використовують воду

дистильовану Р.

Випробовуваний розчин. Кількість випробовуваної речовини, достатню для отримання розчину з концентрацією білка усередині діапазону концентрацій стандартної кривої, розчиняють у буферному розчині, зазначеному в окремій статті.

Розчини порівняння. Стандартний зразок випробовуваного білка розчиняють у буферному розчині, зазнченому в окремій статті. Порції даного розчину розводять таким самим буферним розчином, щоб отримати не менше п'яти розчинів порівняння з концентраціями білка, рівномірно розподіленими

упідхожому інтервалі концентрацій у діапазоні від

0.1мг/мл до 1 мт/мл.

Холостийрозчин. Використовують буферний розчин, використовуваний для приготування випробовуваного розчину і розчинів порівняння.

Реактив кислотний синій 90.0.10 греактиву кислотного синього 90 Z5розчиняють у 50 мл 96 % спирту Р.

Додають 100 мл кислоти фосфорноїР, доводять об'єм розчину до 1000 мл водою дистильованою Р\ перемішують. Фільтрують розчин і зберігають у флаконі з темного скла при кімнатній температурі. У процесі зберігання спостерігається поступове випадання фарбника в осад. Перед використанням реактив слід профільтрувати.

Методика. До 0.100 мл кожного розчину порівняння, випробовуваного розчину і холостого розчину додають 5 мл реактиву кислотного синього 90. Перемішують, перевертаючи, уникаючи спінення. що

64	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

Created for http://www.uapf.com.ua

призводить до поганої відтворгованості. Визначають оптичну густину (>.225) розчинів порівняння і випробовуваного розчину за довжини хвилі 595 нм, використовуючи холостий розчин як компенсаційний розчин. Не використовують кварцові (кремнію діоксид) спектрофотометричні кювети, оскільки фарбник взаємодіє з цим матеріалом.

Розрахунки. Залежність оптичної густини розчину від концентрації білка в розчині не є лінійною; проте. якщо діапазон концентрацій, використовуваних для побудови стандартної кривої, достатньо невеликий, він близький до лінійності. Будують графік залежності оптичної густини розчинів порівняння від концентрацій білка в розчині і, використовуючи лінійну регресію, визначають стандартну криву. На основі стандартної кривої і оптичної густини випробовуваного розчину визначають концентрацію білка у випробовуваному розчині.

МЕТОД 4

Даний метод (зазвичай званий методом біцинхонінічної (біхинонової) кислоти або БХК методом) заснований на відновленні білком міді (Си2") іона до міді (Си1+) іона. Реактив бщинхонінічної кислоти використовують для визначення іонів одновалентної міді. Проведенню реакції заважають декілька речовин. Вплив речовин, що заважають, може бути мінімізований розведенням, що забезпечує концентрацію випробовуваного білка на рівні, достатньому для проведення точних вимірювань. Як альтернатива для видалення речовин, що заважають, може бути використана процедура осадження білка, описана в методі 2. Оскільки різні види білка можуть давати різні за інтенсивністю забарвлення, стандартний зразок білка і випробовуваний білок мають бути аналогічними.

Для приготування всіх буферних розчинів і реактивів, застосовуваних в даному методі, використовують воду дистильовану Р.

Випробовуваний розчин. Кількість випробовуваної речовини, достатню для отримання розчину з концентрацією білка усередині діапазону концентрацій стандартної кривої, розчиняють у буферному розчині, зазначеному в окремій статті.

Розчини порівняння. Стандартний зразок випробовуваного білка розчиняють у буферному розчині, зазначеному в окремій статті. Порції даного розчину розводять таким самим буферним розчином, щоб отримати не менше п'яти розчинів порівняння з концентраціями білка, рівномірно розподіленими у підхожому інтервалі концентрацій у діапазоні від 10 мкг/мл до 1200 мкг/мл.

Холостийрозчин. Використовують буферний розчин, використовуваний для приготування випробовуваного розчину і розчинів порівняння.

БХК реактив. 10 г динатрію біцинхонінату Р. 20 г натрію карбонату моногідрату Р, 1.6 г натрію тар-

=2.5 Методи кількісного визначення

трату Р. 4 г натрію гідроксиду Р і 9.5 г натрію гідрокарбонату Р розчиняють у воді дистильованій Р.

Якщо необхідно, доводять рН розчину до 11.25, використовуючи розчин натрію гідроксиду Р або розчин натрію гідрокарбонату Р. Доводят об'єм до 1000 мл водою дистильованою Рі перемішують.

Мідно-біцинхонінатовийреактив. Змішують 1 мл розчину 40 г/л міді сульфату Р і 50 мл БХК реактиву.

Методика. Змішують 0.1 мл кожного розчину порівняння, випробовуваного розчину і холостого розчину з 2 мл мідно-БХК реактиву. Розчини витримують при температурі 37 °С упродовж 30 хв, відмічають час і залишають суміш до охолодження до кімнатної температури. Не пізніше як через 60 хв після закінчення термостатування визначають оптичну густину (2.2.25) розчинів порівняння і випробовуваного розчину в кварцових кюветах за довжини хвилі 562 нм, використовуючи холостий розчин як компенсаційний розчин. Після охолодження розчинів до кімнатної температури інтенсивність забарвлення продовжує поступово зростати.

Розрахунки. Залежність оптичної густини розчину від концентрації білка в розчині не є лінійною; проте, якщо діапазон концентрацій, використовуваних для побудови стандартної кривої, достатньо невеликий, він близький до лінійності. Будують графік залежності оптичної густини розчинів порівняння від концентрацій білка в розчині і, використовуючи лінійну регресію, визначають стандартну криву. На основі стандартної кривої і оптичної густини випробовуваного розчину визначають концентрацію білка у випробовуваному розчині.

МЕТОД 5

Даний метод (звичайно званий біуретовим методом) заснований на взаємодії міді (Си2") іона з білком у лужному середовищі, яка призводитьдо поглинання за довжини хвилі 545 нм. Це випробування виявляє мінімальну відмінність між еквівалентними зразками lgG і альбуміну. Додавання натрію гідроксиду і біуретового реактиву як комбінованого реактиву, недостатнє змішування після збільшення натрію гідроксиду або перевищення часу між додаванням натрію гідроксиду і додаванням біуретового реактиву дає більш високі значення для імуноглобуліну в порівнянні зі зразками альбуміну. Методика додавання трихлороцтової кислоти, використовувана для мінімізації впливу заважаючих речовин, також може використовуватися для визначення вмісту білка у випробовуваних зразках з концентрацією менше 500 мкг/мл.

Для приготування всіх буферних розчинів і реактивів, застосовуваних у даному методі, використовують воду дистиіьовану Р.

Випробовуваний розчин. Кількість випробовуваної речовини, достатню для отримання розчину з кон-

66 ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4

65?

Created for http://www.uapf.com.ua

=2.5 Методи кількісного визначення

нентрадісю білка усередині діапазону концентрацій стандартної кривої, розчиняють у розчині 9 г/л натрію хюриду Р.

Розчини порівняння. Стандартний зразок випробовуваного білка розчиняють у розчині 9 г/л натрію хлориду Р. ТТорциіїданого розчину розводять розчином 9 г/л натрію хлориду Р. шоб отримати не менше трьох розчинів порівняння з концентраціями білка, рівномірно розподіленими у підхожому інтервалі концентрацій у діапазоні від 0.5 мг/мл до 10 мг/мл.

Холостий розчин. Використовують розчин 9 г/л натрію хюриду Р.

Біуретовийреактив. 3.46 тміді сульфату /'розчиняють в 10 мл гарячої води дистильованоїРі залишають до охолодження (Розчин А). 34.6 г натрію цитрату Р

і20.0 г натрію карбонату безводного Р розчиняють у SO мл гарячої води дистильованої Р і залишають до охолодження (Розчин В). Змішують розчини А і В

ідоводять об'єм водою дистильованою Р до 200 мл. Отриманий реактив використовують упродовж 6 міс. Реактив не підлягає використанню, якщо він стає каламутним або утворюється осад.

Методика. Змішують рівні об'єми випробовуваного розчину і розчину 60 г/л натрію гідроксиду Р. Негайно додають біуретовий реактив у кількості, що дорівнює 0.4 об'єму випробовуваного розчину, і швидко перемішують. Залишають при температурі від 15 °С до 25 °С упродовж періоду часу не менше 15 хв. Не піздніше як через 90 хв після додавання біуретового реактиву визначають оптичну густину (2.2.25) розчинів порівняння і випробовуваного розчину за довжини хвилі 545 нм, використовуючи холостий розчин як компенсаційний розчин. Каламутні розчини і розчини з осадом непридатні для розрахунку концентрації білка.

Розрахунки. Залежність оптичної густини від концентрації білка має приблизно-лінійний характер у вибраному інтервалі концентрацій білка для розчинів порівняння. Будують графік залежності оптичної густини розчинів порівняння від концентрацій білка в розчині і, використовуючи лінійну регресію, визначають стандартну криву. Розраховують коефіцієнт кореляції для стандартної кривої. Система вважається за придатну, якщо лінійна залежність має коефіцієнт кореляції не менше 0.99. На основ стандартної кривої і оптичної густини випробовуваного розчину визначають концентрацію білка у випробовуваному розчині.

Заважаючі речовини. Для мінімізації впливу заважаючих речовин білок може бути осаджений з розчину випробовуваного зразка таким чином: до 1 об'єму розчину випробовуваного зразка додають 0.1 об'єму розчину 500 г/л киаюти трихлороцтовоїР, видаляють надосадовий шар рідини і осад розчиняють в невеликому об'ємі 0.5 М розчину натрію гідроксиду Р. Використовують отриманий розчин для приготування випробовуваного розчину.

МЕТОД 6

Даний флюориметричний метод заснований на дериватизації білка о-фталальдегідом, що взаємодіє з первинними аміногрупами білка (iV-кінцева амінокислота і є-аміногрупа лізинових залишків). Чутливість випробування може бути підвищена гідролізом білка перед додаванням о-фталальдегіду. Гідроліз робить а-аміногрупу вхідних до структури білка амінокислот доступною для реакції з фталальдегідним реактивом. Для даної методики потрібна дуже мала кількість білка. Первинні аміни, такі як трис(гідроксиметил) амінометан і амінокислотні буферні розчини, взаємодіють з фталальдегідом, тому їх не слід додавати і необхідно видалити. Аміак при високих концентраціях взаємодіє з фталальдегідом. Флюоресценція, що отримується при взаємодії аміну з фталальдегідом, може бути нестабільною. Використання автоматизованих процедур для стандартизації даної методики може підвищити її правильність і прецизійність.

Для приготування всіх буферних розчинів і реактивів, застосовуваних у даному методі, використовують воду дистильовану Р.

Випробовуваний розчин. Кількість випробовуваної речовини, достатню для отримання розчину з концентрацією білка усередині діапазону концентрацій стандартної кривої, розчиняють у розчині 9 г/л натріюхлориду Р. Перед додаванням фталальдегідного реактиву встановлюють рН розчину від 8 до 10.5.

Розчини порівняння. Порції даного розчину розводять розчином 9 г/л натрію хлориду Р, щоб отримати не менше п'яти розчинів порівняння з концентраціями білка, рівномірно розподіленими у підхожому інтервалі концентрацій у діапазоні від 10 мкг/мл до 200 мкг/мл. Перед додаванням фталальдегідного реактиву встановлюють рН розчину від 8 до 10.5.

Холостий розчин. Використовують розчин 9 г/л натрію хлориду Р.

Боратний буферний розчин. 61.83 г кислоти борної Р

розчиняють у воді дистильованій Р і встановлюють рН 10.4 за допомогою розчину калію гідроксиду Р. Доводять об'єм розчину до 1000 мл водою дистшіьованоюР і перемішують.

Фталальдегідний основнийрозчин. 1.20 г фталальдегіду /"розчиняють у 1.5 мл метанолу Р, додають 100 мл боратного буферного розчину і перемішують. Додають 0.6 мл розчину 300 г/л макрогол 23 лауршового ефіру Р і перемішують. Зберігають при кімнатній температурі і використовують упродовж 3 тиж.

Фталшіьдегідний реактив. До 5 мл фталальдегідного основного розчину додають 15 мкл 2-меркап- тоетанолу Р. Розчин готують не менше як за 30 хв до використання. Реактив придатний для використання упродовж 24 год.

Методика. Змішують 10 мкл випробовуваного розчину і кожного з розчинів порівняння з 0.1 мл фталальдегідного реактиву і залишають при кімнатній

66	ДЕРЖАВНА ФАРМАКОПЕЯ УКРАЇНИ 1.4 66?