- •Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 1. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1987. – 295 с.
- •Электронное оглавление
- •9. Методы работы с днк 260
- •Предисловие редактора перевода
- •Предисловие
- •Структура книги
- •Особенности книги
- •Организация и передача генетического материала
- •I. Введение
- •Прокариоты: бактерии и сине-зеленые водоросли
- •Одноклеточные и многоклеточныеэукариоты
- •МейозIi
- •Значение мейоза
- •Литература
- •2.Менделевскаягенетика Первые представленияо наследственности
- •Открытие законов наследственности
- •Методы Менделя
- •Доминантность и рецессивность
- •Расщепление
- •Гены - носители наследственности
- •Независимое комбинирование
- •Тригибридные скрещивания
- •27 Гладкие желтые пурпурные
- •Множественные аллели
- •Генотип и фенотип
- •Литература
- •3. Хромосомныеосновы наследственности Гены и хромосомы
- •Наследование, сцепленное с полом
- •Нерасхождение х-хромосом
- •Вторичное нерасхождение
- •Сцепленное с полом наследование у человека и других видов
- •Определение пола
- •Отношение полов
- •Литература
- •4. Природа генетическогоматериала
- •Бактерии как экспериментальныйобъект
- •Экспериментальные исследованиябактериофагов
- •Нуклеиновые кислоты - наследственный материал вирусов
- •Химический состав и строениенуклеиновых кислот
- •Модель структуры днк Уотсона-Крика
- •Проверка модели Уотсона-Крика
- •Различные формы организациидвухцепочечной днк
- •Организация днк в хромосомах
- •Общие особенности репликации днк
- •Литература
- •5. Геномэукариот
- •Рекомбинация сцепленных генов
- •Генетические карты
- •Трехфакторные скрещивания
- •Генетическая интерференция
- •Когда происходит кроссинговер?
- •Мейоз у грибов
- •Цитологические наблюдениякроссинговера
- •Корреляция между генетическими и цитологическими картами хромосомдрозофилы
- •Внеядерная наследственность
- •Литература
- •6. Тонкая структура гена
- •Бактериофаг как генетическая система
- •СистемаrIi бактериофага т4
- •Природа мутаций в областиrIi
- •Функциональные особенностиrIi-мутаций
- •Цистрон
- •КартированиеrIi-мутаций с помощью делеций
- •Предельная разрешающая способностьрекомбинационного анализа
- •Уточнение генетической терминологии
- •Комплементационный анализу высших эукариот
- •Рекомбинационный анализтонкой структуры генау высших эукариот: дрозофила
- •Литература
- •7. Геномвируса
- •Размножение бактериофагов
- •Мутантные бактериофаги
- •Комплементационный анализусловно летальных мутаций фагаХ174
- •Рекомбинационный анализ мутантовфагаХ174
- •Умеренный бактериофагλ
- •Гены фагаλ
- •Профагλ
- •Сопоставление генетическойи физической карт фага а
- •Организация геномафагов т2 и т4
- •Литература
- •8. Бактериальныйгеном
- •МутантыЕ. Coli
- •Генетические элементыE.Coli
- •Физическое картирование бактериальных генов методомпрерванной конъюгации
- •Кольцевая форма геномаЕ. Coli
- •Подвижные генетические элементы (транспозоны)
- •Генетическое картированиеЕ. Coli
- •Конъюгационное картирование
- •Трансдукционное картирование
- •Обзор результатов генетического анализа
- •Литература
- •9.Методы работы с днк
- •Кинетика ренатурации днк
- •Рестрикция днк и ферменты модификации
- •Рестрикционный анализ молекул днк
- •Определение последовательности нуклеотидов в днк ( секвенирование )
- •Метод рекомбинантных днк
- •Векторы для клонирования днк
- •Библиотеки геномов
- •Обзор методов работы с днк
- •Литература
- •Оглавление
Проверка модели Уотсона-Крика
Модель двойной спирали ДНК была предложена в 1953 г. и знаменовала рождение новой науки-молекулярной биологии. Однако прошло пять лет, прежде чем были получены первые убедительные экспериментальные подтверждения модели Уотсона-Крика в работах Мэтью Мезелсона и Франклина Сталя. В этих экспериментах было показано, что в точном соответствии с предсказаниями модели репликация ДНК происходитполу консервативно: каждая дочерняя молекула ДНК состоит изодной интактной (консервативной) цепи, полученной от родительской
4. Природа генетического материала 109
Рис. 4.13. Предложенная Уотсоном и Криком модель репликациидвойной спирали ДНК. |
двойной спирали, и одной вновь синтезированной цепи. С другой стороны, можно представить себе гипотетические механизмы репликации ДНК, которые не предсказываются моделью двойной спирали, а именно: 1) консервативный способ репликации, при котором родительская ДНК полностью сохраняется, а дочерние молекулы ДНК полностью синтезируются заново, и 2) дисперсный способ, при котором обе дочерние молекулы ДНК синтезируются заново, а родительская молекула распадается на нуклеотиды, которые могут входить или не входить в состав дочерних молекул.
110 Организация и передача генетического материала
|
Рис. 4.14. Разделение молекул ДНК с различной плотностью посредством центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Схематически изображены последовательные этапы эксперимента Мезелсона и Сталя, показавшего полуконсервативный механизм репликации ДНК Е. coli. |
4. Природа генетического материала 111
Чтобы определить, каким из этих способов реплицируется ДНК. надо уметь отличать дочерние молекулы от родительских. Мезелсон и Сталь выращивали Е. coli на среде, содержащей в качестве источника азота 15N. Тяжелый изотоп азота 15N включался в состав ДНК и служил меткой. Для того чтобы пометить изотопом 15N практически всю бактериальную ДНК, достаточно вести культивирование на такой среде в течение двенадцати поколений. Молекулы, содержащие 15N, можно отличить от молекул, содержащих более легкий, обычный изотоп, по плотности, так как у ДНК с 15N масса одного нуклеотида больше, чем у обычной ДНК. Молекулы ДНК с различной плотностью могут быть разделены центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (рис. 4.14). В процессе центрифугирования молекулы ДНК собираются в том слое, в котором плотность раствора равна их собственной плотности. ДНК клеток Е. coli, выращенных на среде, содержащей 15N, имеет плотность 1,724 г/см3, тогда как ДНК клеток, выращенных на обычной среде с изотопом 14N, имеет плотность 1,710 г/см3. Смесь этих двух типов ДНК легко разделяется при центрифугировании по плотности (рис. 4.14).
Аналогией, иллюстрирующей принцип центрифугирования в градиенте плотности, может служить погружение подводной лодки. Регулируя количество воды в балластных танках (баках), подводная лодка может зависать на желаемой глубине, плотность воды на которой равна средней плотности подводной лодки. Если набрать в танки больше воды, вытеснив соответствующее количество воздуха, то плотность подводной лодки увеличивается, и она погружается, попадая в слои более холодной воды с большей плотностью. Когда плотность воды оказывается равной плотности подводной лодки, лодка снова зависает на новой глубине.
В эксперименте Мезелсона и Сталя клетки, в течение многих поколений культивируемые на среде с 15N, быстро переносили в среду, содержавшую 14N. Через определенные промежутки времени отбирали пробы растущей культуры и в каждой из них определяли плотность ДНК. Результаты представлены на рис. 4.15. После первого деления на среде с 14N плотность ДНК культуры была промежуточной между [15N] ДНК и [14N] ДНК. После второго деления на среде с 14N половина клеток имела легкую ДНК, а вторая половина - ту же, что и в предыдущем поколении (промежуточную). После третьего деления на среде с 14N 3/4 ДНК имело плотность, равную плотности [14N] ДНК и 1/4 сохраняла промежуточную плотность. Соотношение между числом генераций и распределением плотности ДНК в точности соответствовало полуконсервативному типу репликации, предсказываемому моделью Уотсона-Крика (рис. 4.15).
Кроме того, модель предсказывала, что ДНК с промежуточной плотностью должна представлять собой гибридную двойную спираль, одна из цепей которой содержит только тяжелый изотоп азота (N15), а другая-только легкий. Мезелсон и Сталь нагревали ДНК промежуточной плотности в течение 30 мин при температуре 100°С, что, как уже было известно, изменяет физические свойства молекулы, не разрывая ковалентных связей, и обнаружили, что она превращается в две равные по объему фракции ДНК с разными плотностями. Плотность одной из фракций, образовавшихся в результате нагревания, совпадала с плотностью тяжелой ДНК, а другой-с плотностью легкой ДНК (рис. 4.15).
112 Организация и передача генетического материала
|
Рис. 4.15. А. Распределение плотности молекул ДНК, наблюдавшееся Мезелсоном и Сталем после перенесения растущих клеток Е. coli из тяжелой среды в легкую. Б. Схематическая интерпретация результатов, представленных на А. ДНК, меченная 15N, и вновь синтезируемая ДНК, имеющая 14N, изображены разным цветом. В. Нагревание ДНК промежуточной плотности превращает ее в одноцепочечную ДНК, содержащую две фракции, плотность одной из которых совпадает с плотностью нагретой ДНК, меченной 15N, а другой -меченной 14N. |
4. Природа генетического материала 113
Из этого было сделано заключение, что ДНК промежуточной плотности, образующаяся после первого деления в легкой среде, представляет собой гибридную молекулу, состоящую из одной родительской цепи, содержащей только тяжелый изотоп азота, и другой, вновь синтезированной дочерней цепи, как это предсказывает модель Уотсона-Крика. Аналогичные эксперименты проделывали с реплицирующейся ДНК множества различных прокариотических и эукариотических организмов, и каждый раз оказывалось, что ДНК реплицируется полуконсервативно. Эксперименты Мезелсона-Сталя были первым доказательством справедливости модели Уотсона - Крика. В настоящее время можно с уверенностью сказать, что основные положения этой модели убедительно подтверждены и структура двойной спирали легла в основу современной генетики.