Кинетика ренатурации днк

Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбранной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль. Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетеродуплекса ДНК в главах 7 и 8.

В реакции ренатурации, как показано на рис. 9.1, можно выделить две отдельные стадии. Первая стадия -нуклеация- заключается в образовании водородных связей между несколькими, принадлежащими двум раз-

Рис. 9.1. Последовательные этапы денатурации и ренатурации фрагментов ДНК. Ренатурация требует осуществления двух отдельных реакций: (1) нуклеации - образования водородных связей между двумя одноцепочечными фрагментами; это бимолекулярная реакция, т.е. реакция второго порядка; (2) застегивания, при которой водородные связи образуются между всеми основаниями комплементарных нитей; это мономолекулярная реакция, т.е. реакция первого порядка.

262Организация и передача генетического материала

Рис. 9.2. Кинетика идеальной реакции второго порядка при k₂ = l. По ординате отложена доля одноцепочечных фрагментов в реакционной смеси по прошествии t секунд от начала реакции. По абсциссе отложена величина c₀t, где с₀- начальная концентрация одноцепочечной ДНК в молях нуклеотидов на литр.

ным цепям комплементарными основаниями; остальные взаимно комплементарные основания выстраиваются друг против друга. На данной стадии происходит образование связи между двумя разными одноцепочечными молекулами. Это реакция второго порядка, ее скорость пропорциональна квадрату концентрации ДНК. Вторая стадия -реакция «застегивания молнии», при которой устанавливаются водородные связи между выстроенными друг против друга комплементарными нуклеотидами. Этастадия представляет собой мономолекулярную реакцию ; скорость образования водородных связей пропорциональна концентрации ДНК, т. е. кинетически является реакцией первого порядка. Какая из этих двух стадийидет медленнее и, следовательно, определяет общую скорость ренатурации ДНК, должен решать эксперимент. Показано, что лимитирующей является стадия образования первых связей между цепями.

Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции ренатурации описывается гиперболической функцией (вывод формулы приводится в дополнении 9.1). График зависимости концентрации от времени при k₂ = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени (t_1/2), необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК(с/с₀ = 0,5), можно определять показатель реакции ренатурации (c₀t_1/2). Эта величинапрямо пропорциональна числу нуклеотидов в неповторяющейся последовательности ДНК. Эта закономерность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряязначение c₀t_1/2 ! Более того, экспериментально определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации.

На рис. 9.4 сравниваются кинетика ренатурации ДНК прокариот и эукариот. Обратите внимание на то, что кривая ренатурациии ДНК Е. coli

9. Методы работы с ДНК263

Рис. 9.3. Взаимозависимость между экспериментально определенными значениями с₀t_1/2 и сложностью (N) использованных в эксперименте фрагментов ДНК. При фиксированном значении с₀ время, необходимое для ренатурации половины молекул, пропорционально N. [Britten R.J., Kohne D.E. (1968). Science, 161, 529.]

Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. coli и фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК E. Coli очень близка к теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении константы скорости реакции k₂. Напротив, график кинетики ДНК коровы по форме качественно отличается от изображенного на рис. 9.2. ДНК теленка содержит последовательности ренатурирующие как быстрее, так и медленнее последовательностей ДНК E. coli. [Britten R. J., Kohne D. E. (1968). Science, 161, 529.]

264 Организация и передача генетического материала

Рис. 9.5. На рисунке в виде спектра изображена частота последовательностей ДНК мыши с различной повторностью. Число копий каждого типа последовательности оценивали по кинетике ренатурации ДНК мыши.

log 10 числа повторов

почти тождественна теоретической кривой, представленной на рис. 9.2. Так как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что скорость реакции второго порядка k₂ неизменна, это означает, что ренатурация фрагментированной ДНК Е. coli характеризуется определенным значением k₂. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренатурации фрагментированной ДНК Е. coli, тогда как остальная ДНК (около 60%) ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можнозаключить, что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последовательности, каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, например, основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, частота представленности которых в геноме схематически изображена на рис. 9.5.

Организация и возможные функции многократно повторяющихся нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот были в 60-х годах, после их открытия, предметом активного обсуждения. Около 10% генома мыши составляет совокупность тандемно расположенных последовательностей примерно из 10 нуклеотидов, повторенных 10⁶ раз (рис. 9.5). Эти последовательности ДНК локализованы преимущественно в окружающем центромеры гетерохроматине. Подавляющее большинство этих последовательностей, по-видимому, играют какую-то роль в структурной организации хромосом, поскольку они не транскрибируются в последовательности РНК. С другой стороны, большинство последовательностей с не столь высокой повторностью распределены по всему геному и транскрибируются в РНК. Природа этих последовательностей активно изучается методами рекомбинантных ДНК, о которых мы расскажем в этой главе.

9. Методы работы с ДНК265

Дополнение 9.1 Кинетика ренатурации ДНК

Этапы последовательной денатурации и ренатурации ДНК схематически изображены на рис. 9.1 . Ренатурация комплементарных одноцепочечных молекул в двухцеп очечную происходит в два этапа: 1) нуклеация (зацепление), 2) застегивание (наподобие застежки-молнии). Посколькузацепление включает две одноцепочечные молекулы ДНК, скорость реакции пропорциональна квадрату концентрации ДНК (измеряемому по молярности нуклеотидов) и, следовательно, представляет собой реакцию второго порядка. Напротив, в застегивании принимает участие уже единая двухцепочечная молекула, и потому это реакция первого порядка, а с точки зрения механизма - мономолекулярная. Экспериментально ренатурацияДНК идет в соответствии с кинетикой реакции второго порядка. Следовательно, лимитирующей стадией является установление первых связей между одноцепочечными молекулами (зацепление). Пусть с - концентрация одноцепочечных молекул ДНК в момент времени Г, а с0 - концентрация в начальный момент t = 0. Тогда уравнение реакции второго порядка, описывающее убывание концентрации одноцепочечной ДНК, имеет вид где k2- постоянная скорости реакции второго порядка, или Интегрирование этого уравнения дает При t = 0 с = с0, следовательно, const = Подставляя, получаем

или Время, за которое концентрация убывает вдвое (время полуренатурации), обозначается t1/2. Из предыдущего уравнения откуда На рис. 9.2 представлен график зависимости с/с0 от c0t, он называется с0t-графиком. Ветмур и Дэвидсон показали, что константа скорости реакции второго порядка ренатурации ДНК k2 обратно пропорциональнаN- числу нуклеотидов в неповторяющихся участках нуклеотидной последовательности гаплоидного генома прокариот. Это соотношение задается формулой где L - среднее число нуклеотидов в одноцепочечном фрагменте, β -средняя плотность точек, в которых устанавливается связь между двумя цепями, α -коэффициент. Комбинируя уравнения (3) и (4), мы видим, что величина c0t1/2 прямо пропорциональнаN. (а - коэффициент пропорциональности) : Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК различной сложности. Для молекул ДНК, для которых известны значенияLиN, коэффициент пропорциональности а можно определить по

266Организация и передача генетического материала

набору значений c0t1/2, получаемых при различных условиях эксперимента (при разных температурах и ионных силах раствора). В этом состоит один из наиболее важных результатов исследования кинетики, а именно: используя один и тот же набор условий эксперимента, можно по значению а рассчитать N для ДНК неизвестной природы. На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакциивторого порядка, т.е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина k2 должна изменяться. Для того, чтобы интерпретиро-

вать кривые ренатурации ДНК типа изображенной на рис. 9.4, следует предположить, что в ДНК эукариотических клеток присутствуют различные типы нуклеотидных последовательностей, различающихся сложностью и частотой повторов. Часть ДНК, ренатурирующая медленнее всего (т.е. характеризующаяся наиболее высокими значениями c0t1/2), отвечает уникальным последовательностям, представленным в геноме однократно. Фракции, ренатурирующие более быстро, соответствуют семействам идентичных или очень близких последовательностей, каждая из которых характеризуется определенным значением константы скорости, отражающим сложность (N) семейства. Долю генома, занятую последовательностями того или иного типа, можно оценить по ординате графика, представленного на рис. 9.4.