- •Айала ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. Т. 1. Пер. С англ.: – м.: Мир, 1987. – 295 с.
- •Электронное оглавление
- •9. Методы работы с днк 260
- •Предисловие редактора перевода
- •Предисловие
- •Структура книги
- •Особенности книги
- •Организация и передача генетического материала
- •I. Введение
- •Прокариоты: бактерии и сине-зеленые водоросли
- •Одноклеточные и многоклеточныеэукариоты
- •МейозIi
- •Значение мейоза
- •Литература
- •2.Менделевскаягенетика Первые представленияо наследственности
- •Открытие законов наследственности
- •Методы Менделя
- •Доминантность и рецессивность
- •Расщепление
- •Гены - носители наследственности
- •Независимое комбинирование
- •Тригибридные скрещивания
- •27 Гладкие желтые пурпурные
- •Множественные аллели
- •Генотип и фенотип
- •Литература
- •3. Хромосомныеосновы наследственности Гены и хромосомы
- •Наследование, сцепленное с полом
- •Нерасхождение х-хромосом
- •Вторичное нерасхождение
- •Сцепленное с полом наследование у человека и других видов
- •Определение пола
- •Отношение полов
- •Литература
- •4. Природа генетическогоматериала
- •Бактерии как экспериментальныйобъект
- •Экспериментальные исследованиябактериофагов
- •Нуклеиновые кислоты - наследственный материал вирусов
- •Химический состав и строениенуклеиновых кислот
- •Модель структуры днк Уотсона-Крика
- •Проверка модели Уотсона-Крика
- •Различные формы организациидвухцепочечной днк
- •Организация днк в хромосомах
- •Общие особенности репликации днк
- •Литература
- •5. Геномэукариот
- •Рекомбинация сцепленных генов
- •Генетические карты
- •Трехфакторные скрещивания
- •Генетическая интерференция
- •Когда происходит кроссинговер?
- •Мейоз у грибов
- •Цитологические наблюдениякроссинговера
- •Корреляция между генетическими и цитологическими картами хромосомдрозофилы
- •Внеядерная наследственность
- •Литература
- •6. Тонкая структура гена
- •Бактериофаг как генетическая система
- •СистемаrIi бактериофага т4
- •Природа мутаций в областиrIi
- •Функциональные особенностиrIi-мутаций
- •Цистрон
- •КартированиеrIi-мутаций с помощью делеций
- •Предельная разрешающая способностьрекомбинационного анализа
- •Уточнение генетической терминологии
- •Комплементационный анализу высших эукариот
- •Рекомбинационный анализтонкой структуры генау высших эукариот: дрозофила
- •Литература
- •7. Геномвируса
- •Размножение бактериофагов
- •Мутантные бактериофаги
- •Комплементационный анализусловно летальных мутаций фагаХ174
- •Рекомбинационный анализ мутантовфагаХ174
- •Умеренный бактериофагλ
- •Гены фагаλ
- •Профагλ
- •Сопоставление генетическойи физической карт фага а
- •Организация геномафагов т2 и т4
- •Литература
- •8. Бактериальныйгеном
- •МутантыЕ. Coli
- •Генетические элементыE.Coli
- •Физическое картирование бактериальных генов методомпрерванной конъюгации
- •Кольцевая форма геномаЕ. Coli
- •Подвижные генетические элементы (транспозоны)
- •Генетическое картированиеЕ. Coli
- •Конъюгационное картирование
- •Трансдукционное картирование
- •Обзор результатов генетического анализа
- •Литература
- •9.Методы работы с днк
- •Кинетика ренатурации днк
- •Рестрикция днк и ферменты модификации
- •Рестрикционный анализ молекул днк
- •Определение последовательности нуклеотидов в днк ( секвенирование )
- •Метод рекомбинантных днк
- •Векторы для клонирования днк
- •Библиотеки геномов
- •Обзор методов работы с днк
- •Литература
- •Оглавление
Общие особенности репликации днк
Нативные молекулы ДНК очень велики и при экстракции из клеток обычно разрываются в результате физических или ферментативных воздействий. Мезелсон и Сталь в своих экспериментах по репликации ДНК Е. coli имели дело со сравнительно небольшими фрагментами ДНК, и полученные ими результаты относятся только к состоянию ДНК, предшествовавшему репликации и после нее. Полная репликация хромосомы Е. coli впервые наблюдалась Джоном Кейрнсом. Он разработал метод очень мягкого разрушения клеток Е. coli. В результате Кейрнсу удалось выделить интактные хромосомы Е. coli и пометить их радиоактивным 3Н-тимидином. Меченые хромосомы аккуратно переносили из раствора на твердую поверхность, которая затем покрывалась в темноте фотографической эмульсией и в течение нескольких недель экспонировалась. В это время электроны, испускаемые радиоактивной ДНК, вызывали образование зерен серебра в фотоэмульсии вдоль молекул ДНК. Последующая обработка эмульсии дает радиоавтограф хромосомы, на котором цепочка зерен серебра отслеживает конформацию молекулы ДНК. Применение метода радиоавтографии привело прежде всего к установлению того факта, что ДНК Е. coli имеет кольцевую форму (рис. 4.22). Впоследствии было показано, что такую же форму имеет ДНК всех прокариотических организмов, а также вирусов и органелл эукариотических организмов.
В настоящее время для молекул ДНК известны три основные конформации и соответственно три основных способа репликации. Кольцевые молекулы ДНК, например реплицирующаяся форма ДНК фага лямбда, могут реплицироваться способом, обнаруженным на радиоавтографах хромосом Е. coli. Репликация кольцевой молекулы ДНК начинается в определенной точке кольца и приводит к образованию «вздутия», расширяющегося в двух направлениях вдоль хромосомы по мере репликации (рис. 4.22). Этот способ репликации ДНК ведет к образованию промежуточной структуры, напоминающей греческую букву Θ. Тета-тип репликации превращает родительскую кольцевую хромосому в две дочерние кольцевые хромосомы, в каждой из которых сохраняется одна из цепей родительской молекулы ДНК, а вторая цепь заново синтезируется.
Как мы увидим в дальнейшем, жизненный цикл некоторых организмов требует превращения кольцевой хромосомы в линейную. Такое
4. Природа генетического материала 121
|
Рис. 4.22. А. Радиоавтограф целой хромосомы Е. coli, меченной Н3-тимидином. В большую часть кольцевой хромосомы специфическая импульсная метка включается слабо. Участки с высокой специфической активностью указаны стрелками. Они соответствуют месту окончания репликации молекулы ДНК (слева внизу) и началу нового цикла репликации (сверху справа). [Rodriguez R.L., Dalbey M.S., Davern C.I. (1973). J. Mol. Biol., 74, 599.] Б. Начало синтеза родительской ДНК при репликации бактериофага лямбда по тета-типу. (Dr. David Dressier and Dr. John Wolsfson, Harvard University.) B. Схема двунаправленной репликации кольцевой молекулы ДНК. |
122 Организация и передача генетического материала
Рис. 4.23. А. Электронная микрофотография ДНК бактериофага лямбда в период синтеза линейной дочерней молекулы при репликации по сигма-типу. [Kiger J. Α., Jr., Sinsheimer R.L. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 112.] Б. Схема репликации ДНК сигма-типа. |
|
|
4. Природа генетического материала 123
Рис. 4.24. А. Реплицирующаяся ДНК Drosophila melanogaster. Обратите внимание на множество «вздутий», соответствующих участкам репликации ДНК. Изображен фрагмент ДНК, состоящий из 119000 пар нуклеотидов и включающий 23 вздутия (раздвоения). Масштабная черточка соответствует длине последовательности 5000 пар нуклеотидов. [Kriegstein H.J., Hogness O.S. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 135.] Б. Схема двунаправленной репликации линейной молекулы ДНК. |
|
|
превращение происходит при другом типе репликации ДНК, известном под названием сигма-типа (от греческой буквы σ) или «катящегося кольца». Сигма-репликация начинается с разрыва фосфодиэфирной связи в одной из цепей родительской кольцевой молекулы, в результате чего по обе стороны разрыва образуются «голые» 3'-ОН- и 5'-РО4-концы. Затем комплементарная кольцевая цепь служит матрицей для синтеза новой цепи, ковалентно прикрепленной к 3'-ОН-концу разорванной родительской цепи. По мере того как новая цепь наращивается на 3'-ОНконце, 5'-РО4-конец той же цепи смещается, образуя «хвост» кольца. Затем начинается синтез цепи, комплементарной этому хвосту (рис. 4.23). При таком способе репликации промежуточная структура имеет форму буквы «сигма». По мере продолжения репликации кольцевая родительская молекула превращается в две дочерние молекулы, одна из которых кольцевая, а другая -линейная. Сигма-репликация является необходимым этапом жизненного цикла некоторых бактериофагов, в частно-
124 Организация и передача генетического материала
сти лямбда и фХ174. Этот тип репликации имеет место при половой конъюгации бактерий и встречается в оогенезе некоторых эукариотических организмов.
Хромосомы некоторых вирусов и всех эукариотических организмов содержат линейные молекулы ДНК. Репликация линейных молекул начинается в определенных точках с образования репликационных вздутий. В небольших молекулах ДНК вирусов репликация может начинаться с одной точки. В больших молекулах ДНК, образующих хромосомы эукариот, иногда насчитываются сотни точек инициации репликации (рис. 4.24). После образования вздутия оно начинает увеличиваться по мере распространения процесса репликации ДНК в обоих направлениях от точки инициации. По ходу процесса соседние вздутия могут сливаться, а когда вздутие достигает конца молекулы, образуется характерная промежуточная Y-образная конфигурация. Когда репликация заканчивается, из одной линейной родительской молекулы образуются две линейные дочерние, каждая из которых, так же как и родительская, представляет собой двойную спираль.
Процесс репликации ДНК играет ключевую роль в передаче наследственной информации, записанной в последовательности пар оснований от родительской молекулы ДНК дочерним молекулам ДНК, от родительских соматических клеток - дочерним соматическим клеткам и, наконец, от родительского организма - потомкам.