СистемаrIi бактериофага т4

Классический анализ тонкой структуры гена был проведен Сеймуром Бензером на rII-мутантах фага Т4 в 50-х годах. Бензер использовал два селективных преимущества этих мутантов.

Во-первых, rII-мутанты можно отобрать в большом количестве, поскольку при посеве на Е. coli В их негативные колонии имеют очень характерную морфологию. Эти мутанты вызывают быстрый лизис клеток-хозяина, в результате чего их негативные колонии получаются намного крупнее, чем при заражении фагом дикого типа (рис. 6.1). На чашке Петри одна-единственная бляшка rII легко может быть выделена из 2000 бляшек типа rII ⁺. Использование химических мутагенов сильно повышает частоту мутаций rII по сравнению со спонтанной; соответственно независимо могут быть выделены сотни мутантов rII.

Во-вторых, Бензер обнаружил, что rII-мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е, coli К (λ), содержащие профаг λ. rIIмутанты прикрепляются к таким клеткам и вводят в них свою ДНК, но инфицированные клетки погибают, не продуцируя фагового потомства.

162 Организация и передача генетического материала

Таблица 6.1. Морфология негативных колоний фага Т4 дикого типа и rII-мутантов
	Фенотипы при посеве на:
Фаг	Е. coli В	E. coli К (λ)
Т4rII ^+	Мелкие бляшки	Мелкие бляшки
T4rII	Крупные бляшки	Бляшки отсутствуют (леталь)

В то же время фаг Т4 дикого типа (rII⁺ ) нормально размножается в Е. coli К (λ). Это была первая условно летальная система, исследованная в генетике фагов (табл. 6.1). Неспособность rII-мутантов к росту в Е. coli К (λ) дает удобный способ отбора, поскольку на чашке Петри таким способом можно выделить один rII ⁺ -фаг из 10⁶ rII-фагов. Следовательно, имеется возможность идентифицировать фаги дикого типа, возникающие в результате рекомбинации между двумя различными rII-мутантами.

На рис. 6.2 представлена схема эксперимента по скрещиванию бакте-

Рис. 6.2. Схема скрещивания двух мутантных фагов, А и В. Скрещивание осуществляют путем совместного заражения бактерии-хозяина в пермиссивных условиях.

6. Тонкая структура гена 163

риофагов. Клетки пермиссивного хозяина (штамма В) заражают двумя мутантами, затем подсчитывают общее число потомков при высеве на клетки штамма В и число rII⁺ -рекомбинантов. Для этого в качестве хозяина используют штамм К (λ). Так как реципрокные рекомбинанты, т. е. двойные мутанты rII, при этом не выделяются, то считают, что частота их появления совпадает с частотой рекомбинантов дикого типа. Поэтому при расчете расстояния на генетической карте число рекомбинантов дикого типа умножается на два:

Природа мутаций в областиrIi

В модели структуры ДНК Уотсона и Крика предполагается, что замена одной нуклеотидной пары в нормальной нуклеотидной последовательности гена может привести к формированию мутантного фенотипа. Можно предположить, что мутация, в основе которой лежит замена одной нуклеотидной пары, должна обладать следующими свойствами: 1) обратные мутации, переводящие мутантный фенотип в нормальный, должны происходить примерно с той же частотой, что и прямые; 2) ей должна соответствовать определенная точка на генетической карте; 3) такая мутация должна обладать способностью к рекомбинации с любыми другими точечными мутациями, за исключением тех, которые представляют собой независимые замены той же нуклеотидной пары. Некоторые из изученных Бензером rII-мутантов обладали перечисленными свойствами, другие - нет. Данные, представленные в табл. 6.2, показывают, что частота обратных мутаций к дикому типу у различных rIIмутантов, способных к рекомбинации друг с другом, сильно различается. Некоторые из rII-мутантов вполне стабильны и не ревертируют к дикому типу (т.е. не дают бляшек на E. coli К (λ)); другие ревертируют к дикому типу с измеримыми и характерными частотами. Генетическая карта rII-мутантов, представленных в табл. 6.2, изображена на рис. 6.3. Результаты рекомбинационного анализа более широкого набора из 60 независимо полученных rII-мутантов представлены на карте

Таблица 6.2. Характеристика восьми rII-мутантов фага Т4

Мутант	Положение на карте	Частота реверсий
r47	0
r 104	1,3
r101	2,3
r103	2,9
r105	3,4
r106	4,9
r51	6,7
r 102	8,3
По Benzer S., 1955. Ргос. Natl. Acad. Sei. USA, 41, 344.

164Организация и передача генетического материала

Рис. 6.3. Генетическая карта rII-мутаций фага Т4, приведенных в табл. 6.2. Цифры над стрелками указывают расстояния. [Benzer S. (1955). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 41, 344.]

Рис. 6.4. Карта тонкой структуры нескольких участков области rII фага Т4. Числа между стрелками на картах участков а, b, с и d означают процент рекомбинантов дикого типа, возникающих при попарных скрещиваниях между мутантами. [Benzer S. (1955). Ргос. Natl. Acad. Sci., USA, 41, 344.]

6. Тонкая структура гена 165

(рис. 6.4). Тщательное изучение этой карты показывает, что некоторые из rII-мутантов (а именно не ревертирующие к дикому типу) рекомбинируют, давая rII ⁺ потомство не со всеми остальными rII-мутантами, но лишь с некоторыми из них. Соответственно эти мутации занимают на генетической карте участки большие, чем точечные мутации (размер участка зависит от конкретной мутации), и изображены жирными черными линиями, перекрывающими на карте мутации, с которыми они не рекомбинируют. Например, рассмотрим карту области α на рис. 6.4. Мутант 168 рекомбинирует с мутантами 295 и 312, но ни один из этих трех мутантов не дает рекомбинантов дикого типа с мутантом 47. Все эти четыре мутанта рекомбинируют с мутантами 145, 282 и 228. Если мутанты 168 и 295 - это точечные мутации, то мутант 47 должен возникать в результате изменения более чем одной точки на генетической карте (т.е. изменения более чем одной нуклеотидной пары).

Относительно мутантов типа 47 было показано, что они представляют собой делеции многих последовательных пар нуклеотидов. Исследование рекомбинации двойных rII-мутантов показало, что такие мутации как бы вырезают из генетической карты участки, расположенные между фланкирующими генетическими маркерами, это неудивительно, поскольку у таких мутантов физически отсутствует участок ДНК между этими маркерами (рис. 6.5).

Из этих исследований был сделан важный вывод: фенотипически неразличимые rII-мутации могут быть следствием либо замены отдельной нуклеотидной пары, либо делеции некоторого числа пар нуклеотидов. Свойства, обнаруживаемые у таких делеции, нельзя считать неожиданными. Действительно, вряд ли утрата некоторого числа нуклеотидных пар может быть обратимым процессом, поскольку при этом должны восстанавливаться точное число и последовательность этих пар. Аналогично скрещивание между носителем такой делеции и штаммом с точечной мутацией, расположенной в участке, отсутствующем у партнера по скрещиванию, не должно приводить к появлению рекомбинантов дикого типа. Ни один из геномов, участвующих в таком

Рис. 6.5. Схема, иллюстрирующая механизм сокращения генетического расстояния между фланкирующими маркерами при скрещивании фаговых мутантов, несущих делецию в одном и том же участке. [Nomura M., Benzer S. (1961). J. Mol. Biol., 3, 684.]

166 Организация и передача генетического материала

скрещивании, не содержит нужной нуклеотидной пары в месте точечной мутации. Следовательно, восстановление нуклеотидной последовательности дикого типа невозможно.