КартированиеrIi-мутаций с помощью делеций

Известно, что при скрещивании мутантов со штаммами, несущими делеции в соответствующей этой мутации области генетической карты, нельзя получить рекомбинантов дикого типа. Этот факт дает в руки исследователей мощный метод анализа, которым Бензер воспользовался для картирования тысяч независимых rII-мутаций. Обдуманно упорядоченный набор делеций, представленный на рис. 6.10, делит rIIобласть на 47 отрезков, определяемых соседними концами различных пар делеций. Для того чтобы новую мутацию отнести к одному из этих 47 отрезков, достаточно произвести чуть больше десятка скрещиваний, при которых фиксируется лишь наличие или отсутствие рекомбинантов дикого типа при посеве на Е. coli К (λ). Эта методика схематически изображена на рис. 6.11. После того как установлена локализация некоторого числа независимых rII-мутаций в определенном отрезке, остается установить лишь их взаимное расположение друг относительно друга, и нет необходимости определять их положение относительно мутаций, локализованных в других участках карты.

Построенная таким способом (рис. 6.12) карта тонкой структуры спонтанных rII-мутаций показывает, что эти мутации более или менее случайно разбросаны по генетической карте. Исключение составляют две «точки», представляющие собой высокомутабильные участки ДНК.

6. Тонкая структура гена171

Рис. 6.10. Делеции, концы которых делят область rII на 47 сегментов. Семь больших делеций, изображенных в верхней части рисунка, позволяют разбить область на семь частей. Остальные делеций делят каждую из этих частей на более мелкие участки. Концы, обозначенные вырезом, не использовались при определении границ участков. Указаны границы цистронов Α и В. [Benzer S. (1961). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 47, 403.]

Эта карта демонстрирует важный факт, что rII-мутации, приводящие к утрате функции, т.е. к одному и тому же фенотипу, могут происходить во многих различных точках цистрона. Ясно, что число возможных аллелей rII очень велико. На реальность более глубокой дифференциации тонкой генетической структуры указывает тот факт, что спонтанные точечные мутации, расположенные в разных частях карты, ревертируют к дикому типу с различными и характерными для каждой мутации частотами. Следовательно, природа этих различных спонтанных мутаций, обусловливающих один и тот же фенотип, не может быть одинаковой. Сравнение карты спонтанных мутаций с аналогичной картой, построенной для мутаций, индуцированных специальными химическими мутагенами, показывает, что участки повышенноймутабильности в этих картах расположены в разных местах, хотя и специфичны для каждой из них (рис. 6.12). Это в свою очередь свидетельствует о существовании еще более тонкой структуры генетического материала. При картировании мутаций, полученных всеми возможными способами, установлена принадлежность 200 мутацийrIIА-цистрону

172 Организация и передача генетического материала

6. Тонкая структура гена173

Рис. 6.11. А. Два последовательных этапа локализации новой rII-мутации в одном из 47 участков карты rII-области. Прежде всего мутант скрещивают со штаммами, несущими делеции «большой семерки», изображенной на рис. 6.10. Число 0 в горизонтальных прямоугольниках слева означает отсутствие выявленных рекомбинантов, число 1 - присутствие рекомбинантов. Число нулей определяет номер крупной части области, к которой принадлежит мутант. Затем мутант скрещивают с каждой из делеции, разбивающих большой сегмент, в которой он локализован, на более мелкие участки. Результаты, получаемые таким образом для различных мутантов, представлены в прямоугольниках, приведенных справа. Число нулей в строке в этом случае определяет более мелкий участок, которому принадлежит мутация. Б. Иллюстрация результатов, полученных при использовании метода быстрого выявления рекомбинантов дикого типа, предложенного Бензером. В начале опыта 0,5 мл культуры Е. call В (пермиссивного хозяина) заражают фагами двух линий: содержащей стандартную делецию и исследуемую мутацию. На каждую клетку при этом должно приходиться примерно по пять фаговых частиц. После того как время, необходимое для адсорбции фага пройдет, капли культуры наносят на полоски стерильной бумаги и раскладывают эти полоски на поверхности чашек, засеянных Е. coli Κλ (рестриктивный хозяин). Если в инфицированных клетках возникли рекомбинанты дикого типа, то они заражают и лизируют клетки Е. coli K(λ). В результате участок, покрытый полоской бумаги, становится прозрачным. Отрицательный результат означает, что доля рекомбинантов составляет менее 10 ^--3 % от всего потомства фага. Появление нескольких прозрачных бляшек на месте пустой бумажки - следствие реверсии к дикому типу в результате точечной мутации. [Benzer S. (1961). Proc. Nail. Acad. Sci., USA, 47, 403.]

и 108 мутаций rIIВ-цистрону. В настоящее время известно, что протяженность rIIA составляет 1800 нуклеотидных пар, а rIIВ-850. Малое количество мутаций во многих участках карты и много меньшее общее число мутаций по сравнению с числом нуклеотидных пар наводит на мысль о том, что область rII еще далеко не до конца исследована. Кроме того, многие мутации могут оставаться невыявленными в силу того,

174 Организация и передача генетического материала

6. Тонкая структура гена175

что возникающие при этом генетические изменения никак не проявляются фенотипически. Вырожденность генетического кода (см. гл. 12) означает, что замены некоторых пар нуклеотидов не приводят к заменам аминокислот в белках, кодируемых соответствующим цистроном. Ясно, однако, что число точек (сайтов) на карте области rII, мутации в которых приводят к изменению в фенотипе, составляет значительную часть от общего числа нуклеотидных пар в этой области.