Умеренный бактериофагλ

Исследования умеренного бактериофага λ внесли важный вклад в генетику. Фаг λ содержит линейную молекулу ДНК длиной примерно 49 000 н. п., то есть почти в 10 раз более длинную, чем геном фага фХ174. Фаг λ представляет большой интерес, поскольку его генетические регуляторные механизмы довольно сложны. Когда чувствительную бактериальную клетку заражают умеренным бактериофагом, например фагом λ (рис. 7.6), возможны два варианта дальнейших событий. В первом случае фаг реплицируется, производит множество потомков и разрушает клетку. Во втором случае фаговая инфекция приводит к лизогенизации клетки, при этом фаг встраивается в бактериальную хромосому и превращается в пассивный участок бактериального генома. В таком состоянии фаг представляет собой профаг или провирус, реплицирующийся лишь как часть генома хозяина и в таком виде попадающий в дочерние клетки. При этом многие гены фага, потенциально летальные для клетки-хозяина, находятся в неактивном состоянии, илирепрессированы. Однако иногда фаг можетиндуцироваться, переводя клетку на путь лизиса; клетка погибает, высвобождая многочисленное потомство фага (рис. 7.6). Таким образом, фаг λ служит моделью генетической системы вирус-хозяин. Изучение его функционирования послужило основой для современных представлений об опухолеродных вирусах млекопитающих, способных встраиваться в геном, таких как вирус полиомы и SV40. В этой главе мы рассмотрим различные типы

7. Геном вируса205

Рис. 7.5. Генетическая карта фага фХ174. Схематически изображены частоты появления рекомбинантов дикого типа при двухфакторных скрещиваниях. Расстояния между черточками соответствуют частоте появления рекомбинантов дикого типа, равной 10^–4. Внутри цистрона А черточки вне круга соответствуют частотам рекомбинации сайтов внутри цистрона А с маркерами в других цистронах; черточки, ориентированные внутрь круга, соответствуют частотам рекомбинаций внутри цистрона А. Границы между цистронами (цветные черточки) проведены условно. Указаны функции каждого цистрона. [Benbow R. M. et al. (1974). J. Virol., 13, 898.]

мутаций, обнаруженные у фага λ, а также генетическую и физическую карты его генома. Экспрессия и регуляция генома фага λ будут подробно рассмотрены в гл. 15.

Гены фагаλ

Для идентификации мутантов фага λ, так же как и других бактериофагов, анализируют негативные колонии (бляшки). Гены фага λ можно разбить на две группы: существенные для формирования негативных колоний (обозначаются прописными буквами) и несущественные (обозначаются строчными буквами или буквами греческого алфавита). Существенные гены идентифицируются с помощью условно летальных мутаций: либо sus, либо ts, как уже обсуждалось выше. Комплемента-

206Организация и передача генетического материала

Рис. 7.6. Возможные пути развития бактериальной клетки, зараженной фагом λ: лизис или лизогенизация. Лизис ведет к появлению фагового потомства и гибели клетки. При лизогенизации клетки в ее хромосому встраивается профаг. Изредка индукция профага переводит клетку на путь лизиса.

ционный анализ этих мутаций показал, что они локализованы в 25 различных цистронах. Семь цистронов отвечают за формирование нормальной головки фага, семь других - за формирование нормального хвостового отростка. Эти гены либо кодируют структурные белки, входящие в состав фага, либо необходимы для правильной сборки фаговых частиц. Два гена обеспечивают лизис клетки и высвобождение потомства фага. Еще два гена необходимы для репликации ДНК фага λ, остальные три гена играют важную регуляторную роль.

Несущественные гены идентифицируются по морфологии негативных колоний или при делециях участков генома, в которых они локализованы. Фаги λ дикого типа при посеве на восприимчивого хозяина образуют мутные негативные колонии, поскольку некоторые из инфицированных клеток становятся лизогенными. Клетки, содержащие профаг λ, иммунны по отношению к заражению фагом λ и поэтому размножаются внутри негативной колонии, делая ее мутной. Некоторые мутации (clear, с) придают фагу способность формировать прозрачные бляшки. Эти мутанты не способны к лизогенизации, и инфицированная ими клетка всегда разрушается. Мутации clear обнаружены в четырех раз-

7. Геном вируса 207

Рис. 7.7. Геном фага λ. Гены, существенные для развития фага, обозначены строчными буквами. А. Процентная шкала расстояний вдоль молекулы ДНК. Б. Генетическая карта, построенная на основании частот рекомбинации. В. Физическая карта, основанная на гетеродуплексном анализе. Г. Некоторые из перестроек, использованные при гетеродуплексном картировании: gal и bio -замещения, b-делеции и замены, влияющие на иммунные свойства фагов лямбдоидного семейства. Д. Распределение генетических функций в геноме.

208 Организация и передача генетического материала

личных генах: cI, cII, cIII и су. Другие несущественные гены идентифицируются по мутантным фагам, которые имеют крупную делецию, но тем не менее способны формировать негативные колонии. Делеции в фаге λ обнаружить легко, поскольку несущие делеции фаги содержат в головке меньше ДНК по сравнению с нормальными, а следовательно, их ДНК характеризуются иной плотностью, что выявляется при центрифугировании в градиенте хлористого цезия. Такие мутации с измененной плотностью ДНК обозначаются буквой Ь. Фаговая частица может утратить до 22% ДНК из середины молекулы, не утрачивая способности формировать негативные колонии. Однако фаги с такими делециями не способны к лизогении или генетической рекомбинации, поскольку у них все же нарушены некоторые функции.

На рис. 7.7 изображена генетическая карта, построенная по данным о частоте рекомбинаций между мутациями, затрагивающими размножение фагов. Замечательная особенность этой карты в том, что гены, ответственные за осуществление родственных физиологических функций, сгруппированы вместе (гены формирования головки, формирования хвостового отростка, гены, ответственные за лизис). Другая важная особенность генетической карты фага λ — это ее линейность: выделенная из фаговых частиц λ ДНК имеет форму линейных двухцепочечных молекул.